Evaluating the cytotoxic effect of crocin on MDA-MB-468 cell line based on apoptosis induction, ER stress, and autophagy markers

Transcription

1 Original Article Evaluating the cytotoxic effect of crocin on MDA-MB-468 cell line based on apoptosis induction, ER stress, and autophagy markers Hamid Heidarzadeh 1, S. Zahra Bathaie 2*, Saeid Abroun 3, Mohammad Ali Mohagheghi 4** 1- Ph.D. Candidate, Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran 2- Professor, Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran 3- Associate Professor, Department of Hematology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran 4- Professor, Cancer Institute, Imam Khomeini Hospital, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran *Corresponding Address: Postal Code: , Department of Clinical Biochemistry, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran **Corresponding Address: Postal Code: , Cancer Institute, Imam Khomeini Hospital, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Received: 22/Aug/2017, Accepted: 16/Sep/2017 Abstract Objective: Crocin, an important saffron ingredient, showed anticancer activity in a variety of cancer types, particularly breast cancer. However, little information is available on the mechanism of its action. Previous studies indicate apoptosis induction by crocin in some cancer cells. This study aims to investigate the effect of crocin on the MDA-MB- 468 breast cancer cell line in order to investigate its effect on caspase 9 (Cas9) and cleaved-cas9, expression and splicing of XBP1, and accumulation of LC3-II. Methods: We used the MTT assay to investigate the cytotoxic effect of crocin on MDA- MB-468 breast cancer cells. Next, Cas9 and cleaved-cas9 levels were evaluated by Western blot analysis. Splicing of XBP1 mrna and expression of the spliced protein (XBP1s) was investigated by RT-PCR and Western blot, respectively. The accumulation of LC3-II was also evaluated by Western blot. The obtained results were analyzed and reported by Image J software. Results: The results showed a time and dose-dependent cytotoxic effect of crocin in MDA-MB-468 cells. The expression of Cas9 and its cleavage, therefore, the ratio of cleaved-cas9/cas9 significantly increased. Crocin treatment led to a noticeable increase in splicing of XBP1 mrna, expression of XBP1s, accumulation of LC3-II, and increased the LC3-II/LC3-I ratio in these cells. Conclusion: The data have shown induction of apoptosis in these breast cancer cell lines after crocin treatment. Because of the observed changes in UPR markers and autophagy, it seems that these pathways are possibly involved in this process and in intracellular regulations. Keywords: Breast cancer, Cleaved-Cas9, UPR, XBP1 splicing, LC3-II accumulation Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), No.4, Pages: Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), No. 4 73

2 ت ٥ ر مقاله اصیل بررسی اثر سمی کروسین بر رده سلولی MDA-MB-468 بر اساس القای آپوپتوز و تغییرات نشانگرهای تنش شبکه اندوپالسمی و اتوفاژی **4 3 *2 1 حمید حیدرزاده سیده زهرا بطحایی سعید آبرون محمد علی محققی 1- دانشجوی دکتزی تخصصی گزوه بیوشیمی ببلینی دانشکذه علوم پزشکی دانشگبه تزبیت مذرس تهزان ایزان 2- استبد گزوه بیوشیمی ببلینی دانشکذه علوم پزشکی دانشگبه تزبیت مذرس تهزان ایزان 3- دانشیبر گزوه همبتولوژی دانشکذه علوم پزشکی دانشگبه تزبیت مذرس تهزان ایزان 4- استبد مزکز تحقیقبت سزطبن بیمبرستبن امبم خمینی دانشگبه علوم پزشکی تهزان تهزان ایزان *آدرس نویسنذه مسئول: ایزان تهزان کذپستی: دانشگبه تزبیت مذرس دانشکذه علوم پزشکی گزوه بیوشیمی ببلینی bathai_z@modares.ac.ir **آدرس نویسنذه مسئول: ایزان تهزان کذپستی: دانشگبه علوم پزشکی تهزان مزکز تحقیقبت سزطبن بیمبرستبن امبم خمینی mamohagheghi@yahoo.com چكيذ دریبفت مقبله: 36/55/31 پذیزش مقبله: 36/56/25 ذف: وش ػ ٥ اص تشو ٥ جبت فلبس صففشا اػت و خ اف ضذ ػشعب ٣ آ س ٢ ا اف ٣ اص ػرشعب رب ثر ٤ رظ ػرشعب سؼرنب دس غب قبت اخ ٥ ش لج ٣ ب داد ؿذ اػت. ثب ا ٤ حب اعالفبت ثؼ ٥ بس و ٣ اص ىب ٥ ؼ اثش ا ٤ ر تشو جر د اػرت. غب قربت ا مب ٢ آس سن ص دس ػب ٤ ش ػ ب ٢ ػشعب ٣ تحت دس ب ثب صففرشا ٤ رب وش ػر ٥ سا رب داد اػرت. دس ا ٤ ر سرظ ؾ ثرب ذف ثشسػ ٣ س ٥ شا ٤ ؾ ث ٥ ب سش تئ ٥ اثش وش ػر ٥ ثرش سد ٠ ػر ٣ MDA-MB-468 ػرشعب سؼرنب دس ؾرش اػرت ترب ث ٥ رب ؿىؼرن وبػرزبص 9 XBP1 تج سش تئ ٥ LC3-II دس ت ٥ بس ؿذ ثب ا ٤ تشو ٥ ت ثشسػ ٣ ؿ د. م اد ي ريش ب: ػ جؾ MTT ثرشا ٢ ثشسػر ٣ اثرش ػر ٣ وش ػر ٥ ثرش سد ػر ٣ رب جشد اػرنفبد ؿرذ. ػرزغ س ٥ رشا ٤ ؾ ط XBP1 وبػزبص اص ش افضاس دس ػغح mrna ث ٥ ب سش تئ ٥ س ٥ شا ٤ ؾ ؿذ )XBP1s( ث تشت ٥ ت ثب RT-PCR ػرنش ثرالت ثشسػر ٣ ؿرذ. ث ٥ رب 9 وبػزبص ؿىؼن ؿذ تج ٥ ض LC3-II ثب س ؽ ػنش ثالت ثشسػ ٣ ؿذ ذ. ٥ رضا ث ٥ رب ا ٤ ر سبسا نش رب ثرب اػرنفبد Image J ث ك ست و ٣ ضاسؽ ؿذ. وتبیج: وش ػ ٥ ث ك ست اثؼن ث د ص ص ب جت شي سد ػ ٣ MDA-MB-468 ؿرذ. ت ٥ ربس ثرب وش ػر ٥ ت ٥٥ رش لبث ت ج ٣ دس فقب ؿرذ وبػرزبص 9 ؿىؼرن آ دس ن ٥ جر افرضا ٤ ؾ ؼرجت Cleaved-Cas9/Cas9 داؿرت. س ٥ رشا ٤ ؾ ط ٥ ض XBP1 سغ اص ت ٥ بس افضا ٤ ؾ ٤ بفت. چ ٥ افضا ٤ ؾ ق ر ٣ داس ث ٥ رب سرش تئ ٥ سش تئ ٥ وتيج گيری: LC3-II افضا ٤ ؾ ؼجت LC3-II/LC3-I دس ا ٤ ػ ب ب ذ ؿذ. ت ٥٥ شات رب ش ب ٢ س ٥ رشا ٤ ؾ ؿرذ )XBP1s( XBP1 تج ر نب ٤ ج ب داد و ا ٤ سد اص ػ ب ٢ ػشعب سؼنب سغ اص ت ٥ بس ثب وش ػر ٥ داربس آس سنر ص ؿرذ. ثرب ت جر ثر ت ؾ ٥ بت دس ػ ٣ مؾ داس ذ. ؼر ٥ ش ب ٢ UPR ات فربط ٢ احن رب ا ا ٤ ر د ؼر ٥ ش ٥ رض دس س ٥ رجشد ػر ثر ػر ت رشي ػر ٣ کليذياژگبن: ػشعب سؼنب وبػزبص 9 ؿىؼن ؿذ ت ؾ ؿجى ا ذ سالػ ٣ س ٥ شا ٤ ؾ XBP1 تج LC3-II پژي ش ایآسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 صفحات: پژي ش ای آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان

3 مقذم بػرت ػرغح حفرؼ بجشت ثمب تىث ٥ ش ػ سؿذ ر ثر ضد ٤ ه ثؼ ٥ بس استجبط ثب فشآ ٤ ذ ب ٢ ػ دس ا شط ٢ ثر ػر دػنشػ ٣ ب ذ خبسج ٣ ب ٢ س ٥ ب اص ثؼ ٥ بس ٢ ؼن ذ. ثر ػر ٥ ا ن ربث ٣ ٥ رب ج ٣ رب ٢ ٤ رب سؿذ ف ا غزا ٣٤ اد ؼ ٥ ش ب ٢ عش ٤ ك اص ؿذ س ض ب ٣٤ ػ ٣ دس د ٤ ذ ثب ب ٢ چ ر ٥ ٣ د رذ. ٥٥ ش ت سا ػ ف ٥ ض ٤ ط ٢ ػ ٣ دسخ س آ بث ٥ ؼ ٣ - ؼ ٥ ش ب ٢ سؿذ ٢ حشن ب ٢ ث سبػخ دس ػ ب سا تجض ٤ ا ٢ -خ د او ؾ ب ٢ بس بوش ى ب ػبخت آس سنر ص لج ٥ ر اص ػ ٣ فشآ ٤ ذ ب ٢ اص ثؼ ٥ بس ٢ و ذ. ٣ فقب ؼ ٥ ش ث ػ ٥ ا ن بة ا شط ٢ ػبص ػ خت تشج ات فبط ٢ )Endoplasmic reticulum stress( ا ذ سالػر ٣ ؿجى ت ؾ فر ثر ػ ٣ فشآ ٤ ذ ب ٢ ا ٤ ػشعب دس =1>. ٣ ؿ د و نش ؾر س ث ٥ ٣ س د س ٥ ؾ ػشعب ٣ ػ ب ٢ ث ٣ س ٤ تىث ٥ ش اػرت سا ىبس ب ٣٤ اص اػنفبد ػشعب دس ب دس دس ب ٣ ا ذاف ٣ ػبصد. ن لف سا ث ٣ س ٤ سؿذ ا ٤ و Crocus ( صففرشا ٥ رب ؿرذ خه وال ب ٢ صففشا خ اف ث د داسا ث د ٥ آ دس ج د تشو ٥ جبت )sativus.l د ب ٢ دس سظ شا اص ثؼ ٥ بس ٢ ت ج سد فشا ا ص ٤ ؼن ٣ تشو ٥ جربت ر ثؼر ٥ بس خر اف اص ٤ ىر ٣ =2>. اػرت ث د اخ ٥ ش دس رب ٣ آثربس اػرت شفنر لرشاس غب قر سد و صففشا ػبثم تبس ٤ خ ٣ حبػ اص =3>. اػت ػشعب س ٢ س ٥ ٥ ش ٢ و ذ ثر ثرذخ ٣ ٥ دس رب ثشا ٢ تشو ٥ ت ث ك ست صففشا اص اػنفبد صففرشا ص ٤ ؼرن ٣ خ اف =4>. ثش ٣ شدد ٥ الد اص ثقذ د لش ث ٤ ظ آ ثب ٤ نبث ٥ ت ب ٢ ث ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای ؿب آ وبس ت ٥٤ ذ ب ٢ س ٥ ىش وش ػر ٥ )Crocetin( وش ػرن ٥ )Crocin( وش ػ ٥ )Picrocrocin( تشو ٥ جبت ا ٤ س ٢ غب ق ا ش ص داسد استجبط اص =2>. اػرت شفنر لشاس سظ شا اص ثؼ ٥ بس ٢ ت ج سد ج فر اص خ ر ع ٣ صففشا فلبس ف ٥ ن ؿ ٥ ٥ ب ٣٤ ؾش مغ ح رب ٢ دس و صففشا س اػت. عج ٥ ق ٣ ثب ٤ تشو ٥ جبت وش ػر ٥ تشو ٥ رت اص بؿ ٣ اػت ب ذ لبث سل ٥ ك ثؼ ٥ بس د اػت. آة دس ح بدس وبس ت ٥٤ ذ ب ٢ اص ٤ ى ٣ و اػت دس صففشا فلبس ػشعب ٣ ضذ افؼشد ٣ ضذ خبك ٥ ت دس چ ر ٥ خن ف و س ب ٢ فش ب اص ف ٣ ن =5>. اػت ؿذ ؿ بخن اخ ٥ ش د ١ ا ذ ف ٣ سظ ؾ ب ٢ سؼرنب ػشعب ص ب ٥ ب دس ػشعب ب ؿب ٤ تش ٤ اص ٤ ى ٣ ش ب ٢ ص ٤ ش ؿ بخت اػت ب ث ٥ بس ٢ ٤ ه و اػت سر ٥ ؾآ رب ٣ اػرت ؿرذ ث ٥ نش حب دس س ص ث س ص آ ف ا ر اص آ تریث ٥ شسرز ٤ ش ٢ ثر د ٥ ر ث ٥ بس ٢ ا ٤ ؿ بػ ٣ ػجت ا ٤ ر ث ٥ رنش س ٥ چ ٥ رذ ٣ جرت ظاد ػ ب ذ ص ٤ بد ٢ ثؼ ٥ بس ساػرنب ٢ دس فشا ا ر ٣ تالؽ ب ٢ د ٥ ث ٥ ٣ ؿ د. ث ٥ بس ٢ ث ٥ ساثغ ٤ بفن ثب ٣ ٥ ف ذ ب ش ب ٢ ؿ بخت سؿذ بس ا جرب حرب دس آ ب سد دس جذ ٤ ذ اعالفبت وف آ ب دس داس رب ٢ اص ث نرش اػرنفبد تحم ٥ مبت ا ٤ ذف اػت. س ؽ رب ٢ ٤ رب داس رب ت ٥ رذ ٤ ب ا ٤ جبد دس ب ثشا ٢ دػنشع ثرشا ٢ ؿرذ اسا ٤ ر جذ ٤ رذ رذ رب ٢ اػربع ثش جذ ٤ ذ دس ب ٣ سؼرنب ػشعب =6>. اػت آ دس دخ ٥ ىب ٥ ؼ ب ٢ ػشعب ػرشعب اص سغ اػت ا ٤ شا ٣ ص ب ث ٥ دس ثذخ ٣ ٥ ؿب ٤ تش ٤ ص رب ثر ٥ دس ثذخ ٣ ٥ اص بؿ ٣ ٥ ش شي فب د ٥ س ٤ ا ر اص ثقرذ ا ٤ رشا دس ػرشعب ا ٤ ر ؿ ٥ ؿ ػ اػت. ا ٤ شا ٣ رضاسؽ ج رب دس و اػت ا آ اص سب ٥٤ تش ػب 10 ػب 8>. =7 اػت ؿذ ث رر ك رخ ٥ ررش ػرربخت جب ٤ ررب ا ذ سالػرر ٣ ؿررجى سبت ط ٤ ى ٣ ف ٥ ض ٤ ط ٤ ه ؿشا ٤ ظ اػت. تشؿح ٣ ب ٢ سش تئ ٥ ثر جرش ٣ و رذ خن سا سش تئ ٥ ب كح ٥ ح خ سد ٣ تب و ؿذ ثبص سش تئ ٥ ب ٢ سبػخ ب ث ػ ٣ ؼ ٥ ش ب ٢ ؿذ فقب سبػرخ ا ٤ ٣ ؿ د. )Unfolded Protein Response: UPR( دس د ب ٣ ا ٤ داسد تیث ٥ ش ػ ٣ شي دس ثمب دس ب سبػخ ا ٤ ٥ ؼت. ؿذ ؿ بخن ث خ ث ٣ اثش ىب ٥ ؼ ؿرجى دس غرب ٣٤ دس سش تئ ٥ رب ٢ ث ػ ٥ ػ ٣ س ٥ چ ٥ ذ ػر ٣ دس س ٥ ب ب ٢ ا نمب ثب و ٣ ؿ د ؿش ؿ ا ذ سالػ ٣ دس ج د ف بكش ث اتلب س ٤ ؼ ٣ ف ا ا ٤ جبد ؼن ث دس ك ست د ث و ٣ ؿ د سش تئ ٥ ب ٣٤ ث ٥ ب ث جش DNA ٣ و رذ ذا ٤ ت شي ٤ ب ثمب ػ ت ث سا ػ خن ف ؿشا ٤ ظ 39 Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N

4 ي مکاران حمیدحیدرزاد Inositol-requiring ( IRE1 سرش تئ ٥ رب ا ٤ ر اص ٤ ىر ٣ =9>. ٢mRNA س ٤ ج و ئربص ٢ فقب ٥ رت ثرب ور اػت )enzyme 1 تجذ ٤ XBP1s ؿذ ٤ شا ٤ ؾ ؿ ث سا XBP1u ذ ٤ شا ٤ ؾ )X-box binding protein 1( XBP1s سرش تئ ٥ ر ٣ و رذ. دس و ٣ و ذ فقب سا ط ب ٣٤ ث ٥ ب س ٤ ؼ ٣ فب ٤ ه ث ف ا خ سد ٣ تب =10>. داسد مؾ ػ اص ٤ ى ٣ ات فبط ٢ ؼ ٥ ش ق ٥ ة سش تئ ٥ ب ٢ حزف فشآ ٤ ذ ؿرجى تر ؾ رب دس ور ػ ٣ ب ٢ ىب ٥ ؼ ور اػت )Autophagy( ات فبط ٢ ٣ ؿ د ت ؾ ٥ ا ذ سالػ ٣ ٥ ض فشآ ٤ ذ ا ٤ ت ج جب ت ع س ث ثشا ٢ ىب ٥ ؼ ٤ ه ت ا ذ ٣ سب ٤ رذاس ػربص ٢ فشآ ٤ ذ ٤ ه ات فبط ٢ ؿ د. ػ شي ٤ ب ثمب ثذ ػ ٣ آػ ٥ ت ؿشا ٤ ظ دس و اػت عج ٥ ق ٣ ؿشا ٤ ظ دس ت لف ٤ رب ػ ٥ ن سالػر اص ثخرؾ رب ٣٤ فشآ ٤ ذ ا ٤ دس ٣ ؿ د تذ ٤ ذ او ئ ٣ ثش شفن دس غب د سا ب ا ذا ه ات فرب ص ب ث رض ثب ب ٤ ت دس ٣ ؿ د تى ٥ )Autophagosome( ؿر د ٣ ض آ دس تشو ٥ جبت ٥ ض ص ثب ات فب ص ؿذ ا ٤ جربد ثرشا ٢ ات فربط ٢ فشآ ٤ رذ آغبص دس اك ٣ مؾ 12>. =11 ULK1 Beclin1 سرش تئ ٥ د ثر ػر ٥ جذاو رذ غرب ٢ ؿج فشآ ٤ ذ ٤ ه ث ػ ٥ ع ٤ ػبص ٢ شح دس ٣ ؿ د ا جب اتب فؼفبت ٥ ذ ٤ ث اتلب ثب LC3-I سش تئ ٥ ؿذ ث ث ٥ ى ئ ٥ ن ٥ ػبخنبس ٢ سش تئ ٥ ٤ ه ف ا ث LC3-II ث ؿذ تجذ ٤ آ ٥ لؼر ت دس غرب ورشد س ٥ ذا ا نذاد ثشا ٢ فؼف ٥ ز ٥ ذ ب ا نمب ٣ سش تئ ٥ ا ٤ تج ٥ شد ٣ لشاس ات فب ص ث ٥ ش ٣ دس ٣ =13>. اػت ات فبط ٢ جش ٤ ب ثشا ٢ ب ش ٢ ث ف ا ػ دس تشو ٥ جربت داس ب اص ثؼ ٥ بس ٢ و داد اػت ب غب قبت ؼ ٥ ش ب ٢ وشد فقب ط ب ث ٥ ب دس ٥٥ ش ت عش ٤ ك اص ػشعب ضذ آثبس ات فبط ٢ )Apoptosis( آس سن ص عش ٤ ك اص ػ ٣ شي ج ر اص ٥ رض آ ررثش ر اد صففشا داس ذ. ت س ٢ ضذ ث ٥ رب ثرش ضذػرشعب ٣ خر اف داؿرن ثب و ؼن ذ تشو ٥ جبت ٣ 18-14>. =2 ٣ زاس ذ اثش خن ف ط ب ٢ ٤ ىر ٣ ث ف ا وش ػ ٥ ث د دخ ٥ احن ب غب ق ا ٤ دس چ ٥ آس سن ص ا مب ٢ دس صففشا ػشعب ضذ نبث ٥ ت ب ٢ اص MDA-MB- ػر ٣ سد دس ات فربط ٢ UPR ؼ ٥ ش ب ٢ دس ؿرذ. ثشسػر ٣ داسد ا ٥ رت ثر د نبػرنبص ٢ ث د ٥ ر و 468 ؿرذ ؿىؼرن 9 وبػزبص ؼجت 9 وبػزبص ؿذ فقب ث بثشا ٤ رب ش ب ٢ ثر ف ر ا )Cleaved-Cas9/Cas9( 9 وبػزبص ث )ت ٥ ررذ س ٤ ؼرر ٣ ػررغح د دس XBP1 ط ث ٥ ررب آس سنرر ص ثرر ف رر ا )XBP1s سررش تئ ٥ )ت ٥ ررذ ط ث ٥ ررب )mrna LC3- ؼررجت افرضا ٤ ؾ LC3-II تج ر UPR رب ش ب ٢ ت ٥ ربس ػ ب ٢ دس ات فبط ٢ ؼ ٥ ش ب ش ف ا ث II/LC3-I ؿذ. ثشسػ ٣ وش ػ ٥ ثب ؿذ ريش ب ي م اد تخلاي ي زعفاران م ا ترکيباب استخراج کريسيه ثر صففرشا اجضا ٢ ػب ٤ ش اص وش ػ ٥ خب قػبص ٢ جذا =19>. ؿذ ا جب ث د ؿذ داد ؿشح سا ا ذاص ٢ لجالا و س ؿ ٣ ػن س ٢ ؿؼن اص سغ صففشا آث ٣ فلبس خنلش ع س ث ر س ٢ جرزة ؿرذ ثرشد فقب 9- آ ٥ ٥ وش بت شاف ٣ س ٢ ع ٥ فػ ج اص اػنفبد ثب ػن اص ؿذ خبس ت حل دس جزة داسا ٢ ثخؾ ؿذ. خ ا ذ ب نش 440 ع دس خرال تحت تجخ ٥ ش اص ثقذ ب( )وش ػ ٥ ب نش 440 ع وش ػر ٥ ؿرذ. تجرذ ٤ سر دس ثر ٥ ف ٥ ٥ ضو رذ دػن ب ت ػظ Infrared ( IR ع ٥ رفػر ج ٣ س ؽ رب ٢ ثرب ؿرذ اػرنخشا تی ٥٤ رذ ثشسػ ٣ ف لش ٢ تح ٥ تجض ٤ )Spectroscopy ؿذ ح ػش فبلذ وت ح ٥ ظ دس حبك س دس ب ٤ ت دس ؿذ. ؿذ. اػنفبد تحم ٥ ك ع ٣ سل ل کطت MDA-MB-468 رخب ٤ ش شوض ػر ٣ ثب ه اص MDA-MB-468 ػ ٣ سد ورت حر ٥ ظ دس ؿرذ خش ٤ رذاس ٢ ا ٤ رشا ط ن ٥ ىر ٣ ص ٤ ؼن ٣ Dulbecco's Modified Eagle Medium: ( DEMEM-F12 40 آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 پژي ش ای 04

5 ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای ؿذ. حبػج 10 غ ؾرت ثرب آ ش ٤ ىرب( Gibco( )Nutrient Mixture 12-F 41 Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N ا ى ثبت س ث وت T25 ػ وت فالػه دس ػش دسكذ ؿذ. نم CO 2 دسكذ 5 غ ؾت شع ة ا ٢ ثب MTT سىجص کريسيه تعيايه ي سميت بررسی IC50 اص IC50 تق ٥ ر ٥ وش ػر ٥ ػ ٥ ت ٥ ضا ثشسػ ٣ ؾ س ث 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-= MTT آص ررررررررر اػرنفبد ص ٤ رش ثر كر ست <diphenyltetrazolium bromide خب ر 96 س ٥ رت دس MDA-MB-468 رب ٢ ػر اثنرذا ؿذ. ٥ رشد لشاس ػ اب ه ش دس و ث ك ست ٣ سؿرذ اؼرج ٥ ذ اص ثقرذ ؿرذ ذ. داد ورت وب ح ٥ ظ دس 48 ترب )24 دسكرذ حرذ د ػر ٣ ترشاو ب ػ دس ػربفت ثر رذت ػر رب ػربفت( دس رش ٥ ر ٣ 5-1 ث ٥ ب ٢ غ ؾت ثب وش ػ ٥ تشو ٥ ت قشم رذ ت ٥ ربس ب ٢ ػ آص ب ٤ ؾ ا ٤ دس ؿذ ذ. ت ٥ بس ٥ نش ٣ ٥ ت ٥ ربس ص رب زؿرت اص سرغ ؿرذ ذ. اػرنفبد و نش ث ف ا )5 حرربMTT٢ وررت حرر ٥ ظ ٥ ىش ٥ نررش 100 حررذ د ثر رذت جذدا ؿذ اضبف اب ه ش ث ٣ ٥ ش / ٥ ٣ ٥ نش( ؿرذ ذ. داد ا نمب ػب ن ٣ شاد دسج 37 ا ى ثبت س ث ػبفت 4 تخ ٥ ب ػ س ٢ وت ح ٥ ظ ػبفت 4 زؿت اص سغ ررش ثرر )Dimethyl sulfoxide( DMSO ٥ ىش ٥ نررش 100 شصا رذ دس دل ٥ مر 10 ثر رذت س ٥ رت ؿرذ. اضربف اب ره ا ٤ جربد )Formazan( ف س ربصا ترب ؿرذ داد لرشاس )Shaker( خر ا ؾ دػرن ب و ه ث ػزغ ؿ د. ح وب ع س ث ؿذ جزة ٤ ضا ا ؿرذ. ثجت ب نش 570 دس اب ه ش ب ٢ ح رذ ت ٥ ربس و نرش رب ٢ ػر ٢ ثمب ٥ ضا آص ب ٤ ؾ ا ٤ دس دس ب ػ ثمب ٢ ٥ ضا ادا دس ؿذ. شفن ؾش دس 100 دسكذ آ دس ص رذ ػر رب ٢ دسكرذ ث كر ست ت ٥ بس حب ت ش ت ٥ بس حب ت دسكرذ( 100 ثمرب ٢ )ثب ذ ت ٥ بس ب ٢ ػ ث ثرش وش ػر ٥ ػ ٥ ت ٥ ضا تق ٥٥ ثشا ٢ IC50 د ص ؿذ. حبػج آص ب ٤ ؾ ا ٤ دس د ص ث اثؼن ص ب ث اثؼن داس اػبع سل لی رد تيمبر MDA-MB-468 م لك لی بررسی بی ب مىظ ر کريسيه ترکيا بب XBP1s سش تئ ٥ رب ٢ ث ٥ ب ثش وش ػ ٥ اثش ثشسػ ٣ ث ؾ س LC3- سرش تئ ٥ تج 9 وبػزبص سش تئ ٣ ٥ RNA ػغح دس ػرب ن ٣ نرش ٢ 6 س ٥ ت ب ٢ دس MDA-MB-468 ػ ب ٢ II ثرب ؿذ ذ. داد وت DMEM-F12 وب وت ح ٥ ظ حب ٢ دس وش ػ ٥ د ح ثب ػ ب دسكذ ٢ 70 تشاو ب ذ ت ٥ ربس )IC50( ٥ ٣ ٥ نرش دس ٣ ٥ ش 3 غ ؾت ثب وت ح ٥ ظ ثب ػ ب ت ٥ بس اص سغ ػبفت ص ب ب ٢ دس ؿذ. ثررب ؿؼرن خ رره )Phosphate buffered saline( PBS س ٤ زررب ثرربفش ٥ ىش ٥ نررش 200 تررب 150 اػررىب زش اص اػررنفبد ج رآ س ٢ )Radioimmunoprecipitation assay buffer( ػب ن ٣ شاد دسج 4 د ب ٢ دس ػب نش ٤ ف ط اص ثقذ ؿذ فلبس ث ف ا س ٣٤ ح دل ٥ م 10 ث ذت دل ٥ م دس د س ؿذ. اػنفبد ثالت ػنش تح ٥ ا جب ثشا ٢ ػ ٣ وساخ بارداری پليماراز- زوجيار ای ياکاىص معك س )RT-PCR( ػ ب ٢ ج آ س ٢ اص ثقذ RNA اص cdna ا ٤ جبد ثشا ٢ ( EDTA تش ٤ زؼررر ٥ - ت ػرررظ ؿرررذ ت ٥ ررربس Trypsin- ثرب ػ ب ؿؼن ٢ )Ethylenediaminetetraacetic acid شاحر ث تشت ٥ رت RNA اػنخشا ػ سػ ة ت ٥ PBS و ٥ رت دس ؿذ ٤ بد اثنرذا GeneAll Biotechonolgy Co. Ltd. ح رب اص اػنفبد ثب ٥ ض )Trizol( تشا ٤ ض ٥ ٣ ٥ نش 1 ثب حرب ٢ آة ٥ ىش ٥ نش 50 دس RNA ب و ٥ ت دس ج د ػن ثرشا ٢ ؿذ ج آ س ٢ )Diethyl pyrocarbonate( DEPC فش ٤ ضس ث ػشفت ث ثقذ ٢ آص ب ٤ ؾ ب ٢ RNA و ٥ ف ٥ ت ثشسػ ٣ RNA و ٥ ف ٥ رت چ ر ٥ ؿرذ. نمر ػب ن ٣ رشاد دسج 80- اػرنخشا ثرشا ٢ دسكرذ 0/8 آ ربسص ط اص اػرنفبد ثرب ؿرذ

6 HyperscriptTM RT Mastermix و ٥ رت اص اػنفبد ثب ؿذ ا جرب RT-PCR اور ؾ ج ث ٣ وش GeneAll ؿشوت Kit ؿذ. ػبخن ؾش سد cdna PCR ياکىص ي مکاران حمیدحیدرزاد 28sRNA 18sRNA آؿىبسػربص ٢ ادا ر دس ؿرذ. ثشسػر ٣ ع دس RNA س ٢ جزة ؼجت ب دساح دػن ب ث ػ ٥ 230 ثر رب نش 260 ب نش 280 ث ب نش 260 ب ٢ ر س ٢ جرزة رؼجت و ر رب ٣٤ اص ؿذ. ػ جؾ ب نش ر س ٢ جرزة ؼجت 2/2 ترب 1/8 ٥ رب رب نش 260/280 ؿرذ ػربخن ثررشا ٢ داؿررن ذ 1/9 تررب 1/7 ٥ ررب 260/230 ر RT-PCR اور ؾ ا جرب ثرشا ٢ ؿذ. اػنفبد cdna ثرشا ٢ PCR اور ؾ ؿذ اػنفبد )Primers( آغبص ش ب ٢ ا ث ف ا cdna اص اػنفبد ثب XBP1 ط ب ٢ ث ٥ ب ثشسػ ٣ 1(. )جذ شفت ا جب ص ٤ ش آغبص ش ب ٢ شفن ؾش دس ا ث ف ا لج شح دس آ ذ ث دػت RNA آ ب خلبت اػنفبد سد آغبص ش ب ٢ ٥ ؼت 1 جذيل ژن آغبزگر ت الی ببز( )جفت محص ل اوذاز سبوتیگراد( )درج دمب -سيت زیه گ اويه درصذ 45/45 54/55 58/4 61/ :UXBP1 257 :sxbp1 TTACGAGAGAAAACTCATGGCC ج ٣٤ : GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC ثش ن ٣ : XBP1 بال يسترن اونرβ-( ٥ ثنرب ث ٥ رب اص آص رب ٤ ؾ ا ٤ دس ؿذ. ؽب ش ساد ٤ شاف ٣ ػرنش داخ ر ٣ و نش ف ا ث )ab :4000( )actin ؿذ. اػنفبد ثالت آمبری تحليل ؿذ. ا جب د تب ٣٤ ث ك ست ش ث شث ط آص ب ٢ تح ٥ ر اػت ؿذ داد ب ٤ ؾ mean±sd ث ك ست ب داد One Way آص SPSS 19.0 ش افضاس اص اػنفبد ثب داد ب ػررغح ؿررذ. ا جرب )Post Hoc-Tukey HSD( ANOVA ؿرذ. شفنر ؾش دس )0/05>P( 0/05 اص و نش ب داد داس ق ٣ ثرب ثر د ق ر ٣ داس آ ربس ٢ ؾرش اص آ ب اخنالف و داد ب ٣٤ اػت. ؿذ خق ***( ** )* ػنبس فال ت وتبیج تخلي کريسيه اص صففرشا اجرضا ٢ ػرب ٤ ش اص وش ػر ٥ جذاػربص ٢ ثرشا ٢ =19>. ؿرذ اػرنفبد ثر د ؿرذ ا رذاص ٢ سا لجالا و ب ٣٤ س ؽ SDS- ط اص اب ره رش دس غب قر اص ثخرؾ ا ٤ ر دس Sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide ( PAGE 20 حب ٢ ػ ٣ فلبس دسكذ( )12 )gel electrophoresis )Bradford( ثشادفرر سد س ؽ ثرر ورر سررش تئ ٥ ٥ ىش ررش ا ىنش ف سص ا جب اص سغ ؿذ ثبس زاس ٢ ث د ؿذ ا ذاص ٥ ش ٢ اص سرش تئ ٥ ا نمب ف ػبفت( ٥ ٤ ه تب ٤ ه ت )110 ثرشا ٢ )Polyvinylidene fluoride( PVDF غب س ٢ ث ط ر ٥ ٤ ره تب ٤ ه ث ذت ٣ ٥ آ زش )400 ثالت ػنش ا جب غرب سش تئ ٥ ا نمب اص اع ٥ ب اص سغ شفت. ا جب ػبفت( 5 اشثر ٣ ثرذ خره )ؿر ٥ ش و رذ ؼرذ د ثربفش دس PVDF sc-( XBP1 ا ٥ آ ن ٣ ثبد ٢ ح دس آ اص سغ دسكذ( Cas9 )ab :2000( LC3-II )7160-1:1000 لررررشاس )9502S-1:1000( Cleaved-Cas9 )C3465-1:500( ث نل ثب ٤ آ ن ٣ ثبد ٢ ث اتلب ؿؼن اص سغ ؿذ. داد ررب ٣٤ ؿؼنر ٢ )1:10000 ا ٤ ررشا Razi Biotech( HRP و ٥ رت اص اػرنفبد ثرب PVDF غرب ب ٤ رت دس شفرت. ا جرب X-Ray فررررر ٥ Amersham ECL AdvancedTM 42 آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 پژي ش ای 04

7 ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای ر سد ػربخنبس چ ٥ وش ػ ٥ ٢ ثب خ ف ب د ذ س ؽ ب ٢ اص وش ػ ٥ ػبخنبس تق ٥٥ خ ف ثشسػ ٣ ث ؾ س 1(. )ؿى ث د اػنفبد سد س ؽ دس ا نؾبس نب ٤ ج ؿذ. اػنفبد ف لش ٢ تح ٥ تجض ٤ IR ػ ج ٣ ع ٥ ف ج O 36/8 - N - - H 6/7 7/01 C 56/49 56/74 ف لش )دسكذ( ثؼن فش ج ب ٢ ثش ف بكش ٥ ضا )دسكذ( ف بكش تجشث ٣ ٥ ضا صففشا ؿ بػب ٣٤ ثشا ٢ تی ٥٤ ذ ٢ آص ب ٤ ؾ ب ٢ 1 ضكل اػنخشا وش ػ ٥ جزث ٣ ع ٥ ف ) )ا ف ؿذ وش ػر ٥ دس فرب ٣ ش ب ٢ تق ٥٥ ثشا ٢ IR ع ٥ فػ ج ٣ نب ٤ ج )ة( ( ف لش ٢ تح ٥ تجض ٤ نب ٤ ج ) 43 Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N

8 ي مکاران حمیدحیدرزاد بار کريسيه مختلف غلظت بی سل لی سميت سل ل بی MDA-MB-468 رشي جرت و وش ػ ٥ اص رثش ٢ غ ؾت ثشسػ ٣ ثشا ٢ MTT آص ر اص ٣ ؿ د )IC50( ب ػ اص ٣ ٥ دس ػ ٣ ػرشعب رب ٢ ػر آص رب ٤ ؾ ا ٤ دس 2(. )ؿى ؿذ اػنفبد نفرب ت د ص رب ٢ دس وش ػر ٥ ثرب MDA-MB-468 سؼرنب دس چ ر ٥ ٥ ر ٥ ٣ نرش دس ٥ ر ٣ رش 5-1 ثر ٥ وش ػر ٥ ا ٤ ر ث ؿذ. ت ٥ بس ػبفت نفب ت ب ٢ ص ب ثر اثؼرن ث ك ست ب ػ ت ٥ بس ثب MTT آص ب ٤ ؾ تشت ٥ ت ا جررب MDA-MB-468 ػرر س ٢ وش ػرر ٥ دص ص ررب ؾرش دس و نرش ش ث ف ا ذ ت ٥ بس ػ ب ٢ شفت ؿذ. شفن ضكل ا ٤ ر اص ٤ ره ش رثش د ص تق ٥٥ ثشا ٢ 72( )12 نفب ت ص ب ب ٢ وش ػ ٥ خن ف غ ؾت ب ٢ دس MDA-MB-468 ػ ث د ص ذ ٥ ضا داس 2 ث د. ٥ ٣ ٥ نش دس ٣ ٥ ش 3 ثشاثش ػبفت 48 ص ب دس وش ػ ٥ IC50 غ ؾت اػت. ؿذ داد ب تشو ٥ جبت ضكل اػنخشا RNA ب ٢ آ بسص ط 3 وش ػ ٥ ثب ؿذ ت ٥ بس MDA-MB-468 ػ ب ٢ اص ؿذ 44 آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 پژي ش ای 00

9 ژن بيبن XBP1 در RNA سطح MDA-MB-468 ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای سل ل ابی در کريسيه بب ضذ تيمبر ط ٤ رشاؽ ثرش وش ػر ٥ ف ىرشد تق ٥ ر ٥ ثرشا ٢ ادا دس ث ف ا XBP1s ػ ب ٢ دس ا ذ سالػ ٣ ؿجى ت ؾ ب ش 3 ثرب ت ٥ ربس اص ثقرذ ػ ب MDA-MB-468 سؼنب ػشعب ص ب ب ٢ ف اك دس وش ػ ٥ ٥ ٣ ٥ نش ثش ٣ ٥ ش ثشسػر ٣ ؿرذ. اػنخشا آ ب RNA ؿذ ج آ س ٢ ػبفت ثب رذ ب ٢ جر د ؿرذ. ا جرب حبكر RNA و ٥ فر ٣ و ر ٣ RNA ث د ػب ب د ذ 28s 18s س ٤ ج ص ٣ RNA ب ٢ ذ ( )تجض ٤ خ سد دػت ؿ ٥ ٥ ب ٣٤ ؾش اص ب اػت. و ٥ ف ٥ ت ص ٤ ؼن ٣ ؾش اص 3(. )ؿى ث د ذ داسا سا ص اػنخشا RNA ب ٢ غ ؾت تق ٥٥ ث ؾ س چ ٥ ؿذ ت ب ٣ جزة ب سش تئ ٣ ٥ آ د ٣ فذ اص اع ٥ ب حل ع دس ب اػنخشا RNA ب ٢ غ ؾت صففشا ؿرذ. خ ا رذ ب نش ب ٢ تشو ٥ جربت ت ٥ بس اص ثقذ لج ؿذ ب ت ب ٣ ثشا ٢ 260/280 ؼجت ؿذ. ٥ ش ٢ ا ذاص آ ر د ٣ جر د فرذ ب د رذ و ث د 2 تب 1/8 ث ٥ تمش ٤ جبا اػت. سش تئ ٣ ٥ RNA داد لرشاس ثرب RT-PCR س ؽ ثر ػر ٥ ادا ر دس ط ٤ رشاؽ cdna ػربخت ا ر ث ف ر ا ؿذ اػنخشا XBP1 ث ف ا كفش( )ص ب ذ ت ٥ بس ػ ب ٢ ؿذ. ثشسػ ٣ ؿذ ذ. شفن ؾش دس و نش ػر دس وش ػر ٥ و داد ب 4( )ؿى حبك نب ٤ ج XBP1 ٤ شا ٤ ؾ ص ب ب ٢ دس MDA-MB-468 فش ت ٥ ذ افضا ٤ ؾ س ذ وشد ا مب سا RNA ػغح دس XBP1s ؿذ. ب ذ ص ب ع دس ؿذ ٤ شا ٤ ؾ فش پاريتئيه ابی بيبن بررسی XBP1s پريتئيه تجمع ي ضذ ضكست کبسپبز سل ل بی در کريسيه 9 وبػرزبص LC3-II MDA-MB-468 باب ضاذ تيمبر 9 وبػرزبص سش تئ ٥ ؿذ ؿىؼن ثش وش ػ ٥ اثش تق ٥٥ ثشا ٢ XBP1s سرش تئ ٥ ث ٥ رب آس سنر ص داخ ٣ ؼ ٥ ش ب ش ث ف ا سرش تئ ٥ تج ر ا رذ سالػر ٣ ؿرجى ت ؾ ب ش ث ف ا سؼنب ػشعب ب ٢ ػ دس ات فبط ٢ ب ش ف ا ث LC3-II دس وش ػرر ٥ ثرب ػرر رب ت ٥ ربس اص ثقرذ MDA-MB-468 ؿرذ. ثشسػر ٣ ثرالت ػرنش ثب ػبفت ب ٢ ص ب شفن ؾش دس و نش ث ف ا كفش( )ص ب ذ ت ٥ بس ػ ب ٢ ؿذ. ور ٣ د رذ ب ا ف( 5 )ؿى تحم ٥ ك اص حبك نب ٤ ج سش تئ ٥ ث ٥ ب ق ٣ داس ٢ ث ع س ص ب ب ٢ دس وش ػ ٥ چ ر ٥ داد. افرضا ٤ ؾ سا MDA-MB-468 ػ دس XBP1s ت ٥ ربس ص ب ب ٢ دس 9 وبػزبص سش تئ ٥ ثشسػ ٣ اص حبك نب ٤ ج ؿىؼرن 9 9 /وبػزبص وبػزبص ؼجت ق ٣ داس افضا ٤ ؾ ب د ذ ص ب ب ٢ دس )Cleaved Caspase9/Caspase9( ؿذ ة(. 5 )ؿى ث د ػبفت 6 كفش ص ب ب ٢ ث ؼجت ػبفت ٤ ه اص LC3-II سش تئ ٥ تج ثشسػ ٣ اص حبك نب ٤ ج ب ٤ ت دس افرضا ٤ ؾ ب ش د ٤ ش عشف اص LC3-II/LC3-I ؼجت عشف كفش ص ب ث ؼجت ص ب ب ٢ دس ؼجت ا ٤ ق ٣ داس ف ر ا ث كفش( )ص ب ذ ت ٥ بس ػ آص ب ٤ ؾ ا ٤ دس ث د. دس و نش و نش ث ف ا ثنب-اون ٥ سش تئ ٥ ث ٥ ب اص ؿذ. شفن ؾش 5 )ؿى ؿذ اػنفبد ثالت ػنش دس داخ ٣.) 45 Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N

10 ي مکاران حمیدحیدرزاد ضكل خن ف ص ب ب ٢ دس MDA-MB-468 ػ دس وش ػ ٥ ت ػظ XBP1 ط mrna س ٥ شا ٤ ؾ ا مب ٢ 4 ث )XBP1u( ذ س ٥ شا ٤ ؾ XBP1 ط )S/U( ذ ؿرذ تجرذ ٤ س ٥ شا ٤ ؾ ثش وش ػ ٥ اثش آ بسص ط ) )ا ف س ٥ شا ٤ ؾ ث ؿذ س ٥ شا ٤ ؾ ؼجتmRNA داس )ة( ص ب ث اثؼن ث ك ست mrna ػغح دس )XBP1s( ؿذ س ٥ شا ٤ ؾ XBP1 )0/565;P( 12 ثب 6 ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت **: )0/000;P( ب ص ب ثم ٥ ثب كفش ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت *: Image J ش افضاس ث ػ ٥ آ ذ ث دػت XBP1 )P;0/888( 24 ثب 12 ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت :*** )P;0/245( 24 ثب 6 46 آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 پژي ش ای 04

11 ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای 5 ضكل Cas9 XBP1s سرش تئ ٥ رب ٢ ث ٥ رب )ا رف( وش ػر ٥ ثرب ؿرذ ت ٥ بس MDA-MB-468 ػ دس آس سن ص ات فبط ٢ UPR دس ب ش سش تئ ٥ ب ٢ ثشسػ ٣ **: )0/000;P( ب ص ب ثم ٥ ثب كفش ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت =*: داخ ٣ ( )و نش ثنب-اون ٥ ث ؼجت XBP1s سش تئ ٥ و ٣ ث ٥ ب )ة( LC3-I LC3-II Cleaved-Cas9 ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت ػبفت ثرشا ٢ 9 وبػرزبص ثر ؿىؼن 9 وبػزبص و ٣ ؼجت ) ( <)P;0/002( 24 ثب 12 ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت :*** )P;0/001( 24 ثب 6 )P;0/982( 12 ثب 6 12 ثرب 6 ث ٥ و ع س ٢ ث ػبفت ثب ػبفت 6 ص ب ث ٥ ق ٣ داس ٥٥ شات ت **: )0/0000;P( ب ص ب ت ب ث ٥ ٥٥ شات ت =*: آس سن ص وبػزبص ؿذ فقب ثشسػ ٣ **: )0/000;P( ص ب ب ثم ٥ ثب كفش ص ب ث ٥ ٥٥ شات =*:ت ات فبط ٢ ؿذ فقب LC3-II/I و ٣ ؼجت )د( ث د.> P 0/05; ػبفت 24 6 ث ٥ P ; 0/001 6 ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت ة داس رب ٢ دس ؿرذ اسا ٤ نب ٤ ج و اػت روش ث ص ) P;0/000 (> 24 ثب 12 ص ب ث ٥ ٥٥ شات ت ***: )0/05;P( 24 ثب 6 )0/001;P( 12 ثب آص ب ٤ ؾ بػت. تىشاس ثبس ػ حذال ٥ ب ٥ تب 47 Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N

12 ي مکاران حمیدحیدرزاد بحث ػ سد ثش وش ػ ٥ ػ ٣ ػ ٥ ت اثش سظ ؾ ا ٤ ع ٣ بجشت نبػنبص غب ق ثشا ٢ و MDA-MB-468 ػشعب ٣ وبػزبص ؿذ فقب MTT ػ جؾ ؿذ. داد ب ؼن ذ ف ٥ ذ ؿرذ ؿىؼرن 9 9 /وبػرزبص وبػرزبص ؼجت افضا ٤ ؾ چ ٥ 9 آ ب ش نب ٤ ج ث د. ػ ب ا ٤ دس آس سن ص ا مب ٢ ب د ذ لبث ث ع س ص ب د ص ث اثؼن ث ك ست وش ػ ٥ و اػت دس داد. ورب ؾ سا MDA-MB-468 ػ رب ٢ ثمب ٢ ت ج ٣ UPR ؼر ٥ ش د ب ش ب ٢ ٥٥ شات ت ثبس ا ٥ ثشا ٢ حب ف ٥ ر ٣ د رذ ب و ٣ ؿ د ضاسؽ ػ ب ا ٤ دس ات فبط ٢ فشآ ٤ ذ دس ؼ ٥ ش د ا ٤ ا احن ب ؼن ذ. دخ ٥ سؼنب ػشعب ػ ب ٢ اص سد ا ٤ دس آس سن ص صففرشا دس رب ٣ ٤ ظ ٣ ب ٢ اص ثؼ ٥ بس ٢ اخ ٥ ش د د دس لرشاس حممرب ت ج سد ثؼ ٥ بس آ ػشعب ٣ ضذ آثبس ٤ ظ ث بس ٢ اثش ثشا ٢ نقذد ٢ ىب ٥ ؼ ب ٢ 18-14>. =2 اػت شفن آ اص ثخر ٣ و اػت ؿذ س ٥ بد ت س ب سؿذ ثش وش ػ ٥ سؿرذ ربس 23-20> =3 ػ ٣ شي آس سن ص ا مب ٢ ؿب ربس 20> =15 ػر ٣ اشخ دس و ٥ ذ ٢ مبط بس ثب ػ نب سش تئ ٥ ربص رب دػرن ٣ سب ٥٤ ت ؾ ٥ =18> ت شاص ب فقب ٥ ت تیث ٥ ش تحت سا نبػنبص فشآ ٤ ذ و اػت )Metalloproteinases( ؿذ داد ب تحم ٥ ك ا ٤ ع ٣ و ب ع س =17>. ٣ د ذ لشاس تر ج ٣ لبث ث ع س MDA-MB-468 ػ ٣ سد ثمب ٢ ٥ ضا دس ٤ بفت. وب ؾ ٥ ٣ ٥ نش دس ٣ ٥ 3 ش اص تش ثب غ ؾت ب ٢ دس تقذاد دس ا ذو ٣ افضا ٤ ؾ ب ش MTT ػ جؾ نب ٤ ج حب ف ٥ )1/5-1 وش ػر ٥ سرب ٥٤ ترش غ ؾرت رب ٢ دس ص ذ ػ ب ٢ سد دس ؿذ اسا ٤ لج ٣ نب ٤ ج ثب و اػت ٥ ٣ ٥ نش( دس ٣ ٥ ش ىب ٥ ؼر ٥ ض لج ٣ غب قبت =18>. داسد تبث HepG2 ػ ٣ ػرب ٤ ش دس ؿذ ثش ب س ٤ ض ٢ شي ا مب ٢ سا وش ػ ٥ ثشا ٢ اك ٣ دس ٥ ر ٣ رش 3 اص تش ثرب غ ؾت رب ٢ دس ػشعب ٣ ػ ب ٢ غب قربت ت رب ٣ حب ف ٥ دس =14>. اػت داد ب ٥ ٣ ٥ نش ػر ٣ سد ب ٢ اص ا اف ٣ دس سا وش ػ ٥ ػ ٣ غ ٥ ش اثش زؿن =15> ػرب آص ب ٤ ر ب ٣ ح ٥ ا ربت 21> =20 غ ٥ شػرشعب ٣ اػت. داد ب دس آس سنر ص ا مرب ٢ دس وبػرزبص ب مرؾ س ٥ ر ٥ غب قبت داد اػرت ب سا وش ػ ٥ ثب ت ٥ بس تحت ػشعب ٣ ب ٢ ػ لج ر ٣ نب ٤ ج تی ٥٤ ذ دس ٥ ض ثشسػ ٣ ا ٤ اص حبك نب ٤ ج 24>. =21 ػر رب ٢ دس ور داد رب ػرشعب ٣ ب ٢ ػ ػب ٤ ش دس سرش تئ ٥ ؿرذ فقب وش ػ ٥ ثب ت ٥ بس تحت MDA-MB-468 ؿرذ ؿىؼرن 9 9 /وبػرزبص وبػرزبص ؼجت افضا ٤ ؾ 9 وبػزبص ا ٤ ر ثر افنبد. اتفبق ت ٥ بس اص ثقذ ػبفت دس ث تشت ٥ ت شوض ٢ فب ث ف ا 9 وبػزبص سش تئ ٥ ؿذ فقب ثب تشت ٥ ت وش ػر ٥ ت ػظ آس سن ص ا مب ٢ داخ ٣ آس سن ص ؼ ٥ ش دس اك ٣ ؿذ. تی ٥٤ ذ ػ ٣ شي فب ث ف ا ػ ب ا ٤ دس ٤ رشا ٤ ؾ فشآ ٤ رذ لر ؿ ت ؾ تحت ػ ب ٢ دس ف با LC3II سرش تئ ٥ تج ر UPR ؼ ٥ ش ب ش ث ف ا XBP1 ؿرذ رضاسؽ ػ ٥ ق ٣ ث ع س ات فبط ٢ فشآ ٤ ذ ب ش ف ا ث ثرش وش ػر ٥ اثش ثشسػ ٣ ا ٤ ع ٣ د ٥ ث ٥ =25-27>. اػت اص سرش تئ ٥ mrna ػغح د ش دس XBP1 ٤ شا ٤ ؾ فشآ ٤ ذ LC3-II/LC3-I ؼرجت LC3-II سش تئ ٥ تج عشف ٤ ه ثرشا ٢ ؿرذ. ثشسػر ٣ ت ٥ بس تحت ػ ب ٢ دس د ٤ ش عشف اص ور ر ٣ سػرذ ث ؾش تحم ٥ ك ا ٤ ٤ بفن ب ٢ اػبع ثش ثبس ا ٥ ثر نق رك mrna ٤ رشا ٤ ؾ ت ؾ ٥ دس رثش ٢ ث ع س وش ػ ٥ ور تشت ٥ ت ا ٤ ث داسد. مؾ ص ب ث اثؼن ؿشا ٤ ظ دس XBP1 ػرغح دس رذ ٤ رشا ٤ ؾ فش ث ؿذ ٤ شا ٤ ؾ فش ب ٢ ؼجت اص ثقرذ ػربفت ػبفت ب ٢ دس تذس ٤ ج ث mrna ثرب ثرالت ػرنش نب ٤ ج داؿت. الحؾ ا ٢ لبث افضا ٤ ؾ ت ٥ بس ؿرذ ٤ رشا ٤ ؾ فرش افرضا ٤ ؾ رب ش لجر شح نب ٤ ج تی ٥٤ ذ ث د. ت ٥ بس ص ب ب ٢ دس XBP1s سش تئ ٥ ؼرجت ور داد رب آ رذ ث دػت نب ٤ ج د ٤ ش عشف اص ٤ بفرت افرضا ٤ ؾ ت ٥ بس اص ثقذ ػبفت 6 ص ب دس LC3-II/LC3-I ٤ بفرت. ادا ر چ ب ت ٥ بس اص ثقذ ػبفت 24 تب افضا ٤ ؾ ا ٤ داد ب سا ات فبط ٢ فشآ ٤ ذ ا مب ٢ دس وش ػ ٥ مؾ ٤ بفن ب ا ٤ سا ثضسي س د ػشعب ٣ ػ ب ٢ دس س ٥ ٥ غب قبت نب ٤ ج =24>. وشد تی ٥٤ ذ 48 آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 پژي ش ای 03

13 ثر ؾرش تحم ٥ رك ا ٤ ع ٣ آ ذ ث دػت ٤ بفن ب ٢ اػبع ثش MDA- ػر رب ٢ ثرش ػ ٣ ػ ٥ ت آثبس وش ػ ٥ ٣ سػذ ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای آ ؿىؼرن 9 وبػرزبص ورشد فقرب عش ٤ رك اص سا MB-468 فب ر ورشد فقرب چر دػن ٣ ثب س ٥ ب ب ٢ ٣ و ذ. اف ب ا احن ب سش تئ ٥ ( mrna ػغح د )دس XBP1s س ٤ ؼ ٣ دس داسد. مرؾ UPR ث اثؼن ؼ ٥ ش ٤ ه دس آس سن ص ا مب ٢ دس ث ٥ رب افضا ٤ ؾ ثب شا LC3-II/LC3-I ؼجت افضا ٤ ؾ حب ف ٥ ؼر ٥ ش ؿذ فقب ث ٥ ب ش ا احن ب ػبفت( 12 ص ب )تب 9 وبػزبص دس آس سنر ص ثب ؼ ٥ ش د ا ٤ دل ٥ ك استجبط اثجبت اػت. ات فبط ٢ ثب ٤ رذ شتجظو ذ ف ا ػب ٤ ش ثشسػ ٣ عش ٤ ك اص ثقذ ٢ غب قبت ؿ د. ثشسػ ٣ تطكر قذرداوی ي سؿرن تخللر ٣ دونرش ٢ سػرب اص ثخ ٣ حبضش غب ق ذسع تشث ٥ ت دا ب ب ٣ سن ٥ جب ٣ ثب و اػت ثب ٣ ٥ ث ٥ ؿ ٣ ٥ تحم ٥ مبت شوض ل ة ؿ بس تحم ٥ مبت ٣ عشح ا جب ت شا سضؿى ٣ ف دا ب خ ٣ ٥ ا ب ث ٥ بسػنب ػشعب اص سا خر د لرذسدسا ٣ ترىش شاتت ٤ ؼ ذ ب اػت. ؿذ ٣ داس ذ. افال ذسع تشث ٥ ت دا ب سظ ٣ قب ت مىببع [1] Appenzeller-Herzog C, Hall MN. Bidirectional crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mtor signaling. Trends Cell Biol 2012; 22(5): [2] Bathaie SZ, Mousavi SZ. New applications and mechanisms of action of saffron and its important ingredients. Crit Rev Food Sci Nutr 2010; 50(8): [3] Abdullaev F. Crocus sativus against cancer. Arch Med Res 2003; 34(4): 354. [4] Karpozilos A, Pavlidis N. The treatment of cancer in Greek antiquity. Eur J Cancer 2004; 40(14): [5] Schmidt M, Betti G, Hensel A. Saffron in phytotherapy: pharmacology and clinical uses. Wien Med Wochenschr 2007; 157(13-14): [6] Carey LA, Perou CM, Livasy CA, Dressler LG, Cowan D, Conway K, Karaca G, Troester MA, Tse CK, Edmiston S, Deming SL, Geradts J, Cheang MC, Nielsen TO, Moorman PG, Earp HS, Millikan RC. Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study. JAMA 2006; 295(21): [7] Mousavi SM, Montazeri A, Mohagheghi MA, Jarrahi AM, Harirchi I, Najafi M, Ebrahimi M. Breast cancer in Iran: an epidemiological review. Breast J 2007; 13(4): [8] Movahedi M1, Haghighat S, Khayamzadeh M, Moradi A, Ghanbari-Motlagh A, Mirzaei H, Esmail-Akbari M. Survival rate of breast cancer based on geographical variation in iran, a national study. Iran Red Crescent Med J 2012; 14(12): [9] Ron D, Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol 2007; 8(7): [10] Samali A, Fitzgerald U, Deegan S, Gupta S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol 2010; 2010: [11] Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, Codogno P. Overview of macroautophagy regulation in mammalian cells. Cell Res 2010; 20(7): Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N

14 [12] Codogno P, Mehrpour M, Proikas-Cezanne T. Canonical and non-canonical autophagy: variations on a common theme of self-eating? Nat Rev Mol Cell Biol 2011; 13(1): [13] Ogata M, Hino S, Saito A, Morikawa K, Kondo S, Kanemoto S, Murakami T, Taniguchi M, Tanii I, Yoshinaga K, Shiosaka S, Hammarback JA, Urano F, Imaizumi K. Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress. Mol Cell Biol 2006; 26(24): [14] Bathaie SZ, Bolhassani A, Tamanoi F. Anticancer Effect and Molecular Targets of Saffron Carotenoids. Enzymes 2014; 36: [15] Ashrafi M, Bathaie SZ, Abroun S, Azizian M. Effect of Crocin on Cell Cycle Regulators in N- Nitroso-N-Methylurea-Induced Breast Cancer in Rats. DNA Cell Biol 2015; 34(11): [16] Sun Y, Yang J, Wang LZ, Sun LR, Dong Q. Crocin attenuates cisplatin-induced liver injury in the mice. Hum Exp Toxicol 2014; 33(8): [17] Festuccia C, Mancini A, Gravina GL, Scarsella L, Llorens S, Alonso GL, Tatone C, Di Cesare E, Jannini EA, Lenzi A, D'Alessandro AM, Carmona M. Antitumor effects of saffronderived carotenoids in prostate cancer cell models. Biomed Res Int 2014; 2014: [18] Noureini SK, Wink M. Antiproliferative effects of crocin in HepG2 cells by telomerase inhibition and htert down-regulation. Asian Pac J Cancer Prev 2012; 13(5): [19] Bolhasani A, Bathaie SZ, Yavari I, Moosavi- Movahedi AA, Ghaffari M. Separation and Purification of Some Components of Iranian ي مکاران حمیدحیدرزاد Saffron. Asian J Chem 2005; 17(2): [20] D'Alessandro AM, Mancini A, Lizzi AR, De Simone A, Marroccella CE, Gravina GL, Tatone C, Festuccia C. Crocus sativus stigma extract and its major constituent crocin possess significant antiproliferative properties against human prostate cancer. Nutr Cancer 2013; 65(6): [21] Hoshyar R, Bathaie SZ, Sadeghizadeh M. Crocin triggers the apoptosis through increasing the Bax/Bcl-2 ratio and caspase activation in human gastric adenocarcinoma, AGS, cells. DNA Cell Biol 2013; 32(2): [22] Luo T, Qin J, Liu M, Luo J, Ding F, Wang M, Zheng L. Astragalus polysaccharide attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in microglial cells: regulation of protein kinase B and nuclear factor-κb signaling. Inflamm Res 2015; 64(3-4): [23] Bakshi HA, Hakkim FL, Sam S. Molecular Mechanism of Crocin Induced Caspase Mediated MCF-7 Cell Death: In Vivo Toxicity Profiling and Ex Vivo Macrophage Activation. Asian Pac J Cancer Prev 2016; 17(3): [24] Bajbouj K, Schulze-Luehrmann J, Diermeier S, Amin A, Schneider-Stock R. The anticancer effect of saffron in two p53 isogenic colorectal cancer cell lines. BMC Complementary and Alternative Medicine 2012; 12: 69. [25] Hetz C. The unfolded protein response: controlling cell fate decisions under ER stress and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol 2012; 13(2): [26] Penas C, Font-Nieves M, Forés J, Petegnief V, Planas A, Navarro X, Casas C. Autophagy, and 50 آسیبشىاسیزیستی دير 02 شمار 4 زمستان 9316 پژي ش ای 44

15 ت سطکريسیهدررد سل لیMDA-MB-468 آپ پت ز تىششبک اوديپالسمیيات فاژی القای BiP level decrease are early key events in [27] Cawley K, Deegan S, Samali A, Gupta S. retrograde degeneration of motoneurons. Cell Assays for detecting the unfolded protein Death Differ 2011; 18(10): response. Methods Enzymol 2011; 490: Pathobiology Research, Vol. 20 ( ), N