להשרות אפופטוזיס בתאים לוקמיים

Transcription

1 שימוש בחלבון הכימרי- CTLA-4-FasL על מנת להשרות אפופטוזיס בתאים לוקמיים Apoptosis induction by CTLA-4-FasL chimeric protein in Leukemia cells עבודת הגמר של התלמיד יונתן איזנברג. כמילוי חלק מהדרישות לשם קבלת תואר דוקטור לרפואה מטעם בית הספר לרפואה של האוניברסיטה העברית והדסה, ירושלים. בהדרכתה של המורה דר' מיכל דרניצקי אלהלל. מחלקה: נפרולוגיה ביה"ח: הדסה עין כרם עיר: ירושלים תאריך:

2 מבוא: עמידות של תאים ממאירים לתהליך מוות תאי מתוכנן )אפופטוזיס( התפתחות מנגנונים המקנים לתאים ממאירים עמידות בפני אפופטוזיס מהווה תהליך מרכזי בהמשך התפתחות הסרטן. בזמן טיפול במחלות ממאירות, השראת מוות תאי סלקטיבי בתאים שעברו התמרה ממאירה הינו אפקט רצוי. תאים לימפוציטים ממאירים מסוגלים לרכוש עמידות בפני אפופטוזיס באמצעות מספר Fas LIGAND דרכים. לדוגמא, אובדן ביטוי של ה- Fas receptor שהינו קולטן ל מאד וחשוב DEATH COMPLEX בהתחלת שפעול התהליך של אפופטוזיס, התערבות ביצירת ה- comlex),(disc- Death inducing signaling התערבות בהפעלת מפל הקספזות ברמת ה- DISC, יצירה מופחתת של קספזות במורד המפל. בנוסף, תוארו מקרים של ביטוי ופעילות יתר של אותות אנטי אופטוטים בשלבים שונים של התהליך. דוגמא לחשיבות מנגנון ביטוי היתר של אותות אנטי-אפופטוטים ניתן למצוא בלימפוציטים )2(. במקרים מסויימים, תאים ממאירים של לימפומה ולוקמיה עמידים בפני אפופטוזיס המושרת בידי כמותרפיה ו/או מתן,Fas-L)CD95L( בין היתר עקב עלייה בביטוי אותות אנטי- אפופטוטים או פרו-הישרדותיים כגון Mcl-1, NF-KB survivin, cflip,bcl-xl ועוד )2(. חשיבות אותות קו-סטימולציה בעליה בביטוי אותות אנטי-אפופטוטיים בלימפוציטים בריאים, העלייה בביטוי אותות אנטי-אפופטוטים מתרחשת בעיקר בזמן שפעולם ומושרת, לפחות חלקית, בתיווך סיגנלים קו-סטימולטורים. דוגמא לאות קו סטימולטורי הוא הקישור בין מולקולת B7 )הנקראת גם CD80 ו- CD86 (, המבוטאת על תאים מציגי אנטיגן לבין CD28 המבוטא על תאי ה- T. קישור זה חשוב מאד בזמן הפעלה של התגובה האימונית של תאי ה- T המגורים על ידי אנטיגן )1,2(. עליה זו בסיגנלים האנטי-

3 אפופטוטיים מעכבת זמנית את מוות תאי ה- T המגורים המושרה על ידי FasL לתגובה האימונית להתקיים )1(. ומאפשרת באופן נורמאלי, תאי T משופעלים גם מבטאים על פני שטח התא חלבונים אשר מעבירים אותות מעכבים על מנת לרסן את התגובה החיסונית, למרות היותם משופעלים. אחד החלבונים המעכבים הידועים הינו ה- CTLA4 שנקשר אף הוא ל- B7.נוצרת כך תחרות בין הקישור. קישור מסוג זה בעצם מונע את המשך הקו-סטימולציה ע"י CD80/86 והמשך שפעול תאי T. בכך נמנעת הפעלת יתר של תאי ה- T בפרט ושל מערכת החיסון בכלל )6(. דוגמא מוכרת לניצול האינטראקציה הבין תאית הזו בקליניקה, היא השימוש בחלבון CTLA4-.Ig מדובר למעשה בחלק החוץ תאי של CTLA4 שקשור לחלק ה- Fc של.IgG1 כאשר חומר זה ניתן למטופלים, הוא מתחרה עם CD28 על הקישור ל- B7 ומפחית את רמת הקו- סטימולציה ובכך מדכא את פעילות מערכת החיסון. חלבון זה נמצא כיום בשימוש קליני במספר מחלות אוטואימוניות, למשל,Rheumatoid arthritis וכן למניעת דחיית שתל במקרה של השתלות כליה. Trans-signal converter proteins (TSCP) לאחרונה, רווחיים יותר ניסיונות שמטרתם לשלב בין חסימה פסיבית של הקוסטימולציה לבין עיכוב אקטיבי של התאים. דרך אחת להביא לעיכוב הקו-סטימולציה מצד אחד ובמקביל לעודד השראת מוות תאי מתוכנן היא באמצעות חלבונים כימריים. בהקשר הזה, קבוצה ייחודית של חלבונים כימריים הנמצאת במחקר היא הקבוצה של ה- (TSCP).Trans-signal converter proteins החלבון הראשון והאבטיפוס למשפחה זו הינו ה-.CTLA-4-FasL חלבון זה מכיל בתוכו את היכולות המשלימות להקשר ל- B7 ולחסום את הקו- סטימולציה דרך הזרוע של CTLA-4 ובמקביל לספק אות מעכב, שיעודד מוות תאי דרך הזרוע של Fas-L ובכך בעצם הופך את סיגנל האות המועבר מתא לתא ממשפעל למעכב )5(.

4 כלומר, יש כאן שילוב בין תהליך שמעכב שפעול תאי T לבין תהליך שמעודד הרג תאי מתוכנן של אותם תאי T. כאשר נבדק החלבון הכימרי CTLA-4-FasL ליכולתו לעכב תאי T משופעלים נמצא כי הוא גורם לתגובה חזקה יותר בצורה משמעותית מאשר השימוש בשני המרכיבים שלו בנפרד או ביחד. הוא נמצא יעיל יותר מ- CTLA-4-Ig ו- sfasl, לחוד או בשילוב, ביכולתו להשרות אפופטוזיס בתאי B או T המבטאים.)6( Fas נתונים שנאספו מהמעבדה שלנו מראים כי תאים שנחשפו ל- CTLA-4-FasL )גם שורות תאים וגם תאי T ו- B ראשוניים( עוברים אפופטוזיס מוקדם באמצעות שני מנגנונים. ראשית יש שפעול של הקולטן שמשרה מוות תאי, Fas, אשר משפעל את מפל הקספזות. המנגנון השני T שפועל הוא דיכוי יצירת החלבון האנטי- cflip אפופטוטי שנמצא ברמות גבוהות בתאי ששופעלו. שילוב של שתי הפעולות הללו מדגים כי חלבון כימרי אחד מסוגל בו-זמנית להשרות אותות פרו-אפופטוטים ולהפחיתאותות אנטי-אפופטוטים ובכך להביא לדיכוי מיטבי.)6-9( ממאירויות של לימפוציטים מסוג B כפי שצוין למעלה, ידוע מהספרות שתאי לימפומה ולוקמיה עמידים בפני תהליך אפופטוזיס המושרת בידי כמותרפיה ו- FasL הודות לביטוי יתר של אותות אנטי-אפופטוטים כדוגמת )22-.2(. כמו כן, הוצע, שהביטוי ביתר של אותם אותות אנטי-אפופטוטים מתרחש cflip B הודות לאותות קו-סטימולטורים שבין CD28-B7 המבוטא באופן לא נורמאלי על תאי B ממאירים )21(. כלומר יתכן שבתאים לוקמים ממאירים מסוג קיימת לולאת השרדות B אוטוקרינית/פרקרינית כך שתאי B יכולים לשפעל תאי ממאירים סמוכים במנגנון של

5 קוסטימולציה. ואכן, הוכח שמניעת לולאת השרדות זו ע"י מתן blocking anti-cd28 Abs מביאה להשראת אפופטוזיס בתיווך )25(. Fas דרך נוספת אפשרית להעלאת ביטוי המולקולות האנטי-אפופטוטיות בתאי הגידול יתכן ונובע T מהיכולת של CD28 המבוטא על פני תאי המסנינים את הגידול להקשר ל- B7 המבוטא על פני תאי ה- B, ולהעביר אות המביא לעלייה בביטוי אותם חלבונים מעכבי אפופטוזיס )26(. לאחרונה, ניסויים במעבדתנו הדגימו כי השריית )אינקובציה( שורות תאי B ממאירים מסוג Raji ו- JY בנוכחות CTLA-4-FasL הביאה תוך זמן קצר לאפופטוזס מהיר. תופעה זו נובעת ככל Fas receptor הנראה מכך שהתאים הנ"ל מבטאים גם B7 )שאליו נקשר ה- CTLA-4 ( וגם )שמגיב עם הFasL ( על ממברנת התא שלהם )26(. CTLA-4-FasL יכול לפעול לא רק בתור,TSCP אלא הועלת ההשערה כי יתכן והחלבון הכימרי גם במנגנון של (CLBP).Cis loop back protein מנגנון ה- CLBP הינו מנגנון אשר בו החלבון הכימרי CTLA-4-FasL פועל למעשה דרך קישור של שתי הקצוות שלו לקולטנים על פני אותו תא )B7 ו- receptor.)fas בצורה זו החלבון לא יהיה תלוי בעצם בנוכחות תא נוסף על מנת ליצור את האפקט הכפול שלו )26(. B באופן מפורט, לחלבון יש את היכולת להקשר מצד אחד ל- B7 שמבוטא על תאי ממאירים ובכך למנוע את הקו סטימולציה עם CD28 שמבוטא באופן אברנטי על אותם תאי B ועל תאי B שכנים או על תאי T המסנינים את הגידול ובמקביל הקישור הנ"ל מהווה מעין עוגן שמצמד את ה- FasL )הזרוע השנייה של החלבון( ל- receptor Fas שמבוטא אף הוא על פני תאי ה- B הממאירים. תאי לוקמיה כרונית )CLL( הם תאים מסוג B לימפוציטים, הידועים בכך שהם עמידים בפני B7 גירויים המשרים אפופטוזיס. לפי הידוע בספרות, תאים אלה מבטאים על קרום התא גם וגם.)21( Fas receptor

6 לכן נראה הגיוני לשער כי יתכן וגירוי מקביל של שתי המולקולות יביא לעליה ברגישות התאים לגירוי אפופטוטי, ועל ידי כך למותם. CTLA4-FasL על מנת לבדוק תיאוריה זו בדקנו בעבודה זו את פעילות החלבון על תאים CLL לימפוציטים מסוג B שהופקו מחולי ועל לימפוציטים מסוג B שהופקו ממתנדבים בריאים והשוונו את אחוז הלימפוציטים שעברו אפופטוזיס ו/או נמק בשתי קבוצות אלו. מטרת העבודה CTLA-4-FasL מטרת העבודה הנוכחית היא לבדוק את היכולת של החלבון להשרות chronic lymphocitic ( CLL אפופטוזיס של תאי B ממאירים כדוגמת תאים של חולי )leukemia הידועים כעמידים יחסית בפני סיגנלים אנטי אפופטוטים. השערות המחקר: החלבון הכימריCTLA-4-FasL ישרה אפופטוזיס בתאי CLL השראת האפופטוזיס תהיה מוגברת בתאים הממאירים מאשר התאים הנורמלים..2.1 CTLA4-Ig פעילות ה- CTLA4-FasL CLL בתאי תהיה גבוהה יותר מאשר פעילות ו-.2 sfasl לבד או ביחד.

7 חומרים ושיטות: 2. מערך המחקר: המחקר הינו מחקר ניסויי השוואתי שאינו סמוי ושאינו אקראי. המחקר נחלק לשני שלבים. B בראשון, בדקנו את השפעת החלבון הכימרי CTLA-4-FasL על שורות תאי ממאירים תוצאות שלב זה פורסמו כבר ובשני הניסוי התבצע על לימפוציטים אשר הופקו מדגימות דם של חולי CLL בהסכמתם ומתנדבים בריאים. 1. אוכלוסיית המחקר: CLL בדקנו את השפעת החלבון הכימריCTLA-4-FasL על לימפוציטים שהופקו מדם של חולי ועל לימפוציטים שהופקו מתורמים בריאים. המחקר אושר על ידי הועדה האתית המוסדית CLL 8 לניסויים בבני אדם. המחקר כלל חולי ושישה מתנדבים בריאים. כדי לקבל את הדגימות, בזמן בדיקות הדם הרוטיניות נלקחו עוד 25 מ"ל לצורך העבודה )ע"פ הפרוטוקול(. מהדם הפקנו לימפוציטים ששימשו לניסוי. לצורך בקרה הופקו לימפוציטים משישה מתנדבים בריאים. 2. טכניקות עבודה ומשתנים: שורות תאים השתמשנו בשורת התאים,RAJI שמקורה בלימפומה מסוג B. תאים אלו ATCC מבטאים על קרום התא את החלבונים B7 ו- Receptor.Fas התאים נרכשו מה Collection(,)American Type Culture וגודלו במדיום,RPMI שהוספו לו גלוטמט, 95%,CO 2 6% סרפטומיצין ופניצילין, וכן %.2 סרום. התאים גודלו באינקובטור, לחות, וטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס. שורות התאים נבדקו אחת לשבוע בכדי לוודא שהם שומרים על המראה האופייני שלהם, קצב גדילה מקורי ושלא הייתה קונטמינציה של הדגימה. כמו כן בדקנו לעיתים תכופות את

8 ביטוין של המולקולות הרלוונטיות על פני התאים. במידה וחל שינוי לא השתמשנו בתאים אלו לניסוי. שללנו זיהום של הדגימה בידי קיטים של PCR למיקופלסמה cells/ml RAJI ניסיונות פרוליפרציה-.5 לקחנו מיקרוליטר של תאי בריכוז של והוספנו לצלוחיות של 96 באריות. לבאריות הוספנו את חלבוני הניסוי sfasl,ctla4-fasl ו- CTLA4-Ig בריכוזים משתנים והדגרנו את הצלוחית ל לאחר שעות. שעות שטפנו את הלוחיות 5x10 4 cells ארבע פעמים עם Raji,PBS הוספנו תאי בכמות של לכל לוחית והשארנו ]H] של thymidine µci באינקובאטור ל 11 שעות נוספות. לאחר מכן הוספנו 027A001MC( )PerkinElmer, Waltham, MA: category number NET ושמנו באינקובציה בטמפרטורה של 21 מעלות, 6% CO 2 ו- 95% לחות ל שעות. לאחר מכן התאים נספרו. לכל ניסויי הפרוליפרציה עשינו 2 חזרות. הפקת תאים מחולי -CLL כל דגימה הייתה כ- 25 מ"ל של דם פריפרי שנאסף לתוך מבחנות עם הפרין. לאחר מכן בודדנו את ה- PBMC )peripheral blood mononuclear cells( באמצעותgradient.FicollHypaque לחולי CLL יש ערכים שונים של לימפוציטים בדם. כדי להתגבר על עובדה זו, כל דגימה כחלק מהכנתה עברה סרכוז, והכמות של תאים שנזרעה בכל בארית של הניסוי הייתה שווה. 1 ml( 11 הזריעה בוצע /ml 5 10 בריכוז של בצלוחיות גדילה עם באריות לבארית(. מדיום 2.%,10 mmhepes הגידול היה RPMI בתוספת סרום אוטולוגי, בגלוטמין ואנטיביוטיקה )פניצילין/סטרפטומיצין(. 2..,2. הטיפולים שבוצעו הינם: הוספת חלבון CTLA-4-FasL בריכוזים עולם של ו-.. 2,)ng/ml ושילוב של החלבונים 2..( anti-fas )ng/ml 2..( CTLA4-Ig חלבון,ng/ml CTLA4-Ig ו- anti-fas. בניסוי שכלל דם ממתנדבים בריאים בדקנו רק את השפעת החלבון CTLA-4-FasL אל מול הביקורת הלא מטופלת.

9 R&D systems ו- sfasl )CTLA-4/Fc( הנוגדנים הרקומביננטים CTLA4-Ig נרכשו מה- Alexis Biochemicals San Diego, CA; ( ומ- (Minneapolis, MN;category number 434-CT) ALX )category number החלבון הכימרי CTLA4-FasL הוכן במעבדה כמתואר בעבר )1(. התאים עברו אינקובציה של 26 שעות ב- 37 מעלות. לאחר האינקובציה התאים נלקחו, נשטפו, ונעשתה צביעה עם הנוגדנים הפלואורוסנטיים כנגד CD19 מצומד לAPC )לזיהוי של Propidium ו- Iodide Annexin V התאי B(, וכמו כן צביעה עם כדי לזהות אפופטוזיס FACSCalibur תוצאות נקראו במכשיר (MBL, Medical & Biological Laboratories Co,( ובוצע אנליזה באמצעות תוכנת.CellQuest 1. חלקי במחקר: חלקי המעשי בעבודה היה לבצע ניסויים עם שורות התאים, לגייס את החולים והמתנדבים הבריאים למחקר, להפיק את הלימפוציטים מהדם הפריפרי, לבצע את הניסויים עם גם שורות התאים וגם עם התאים מהחולים ומהמתנדבים הבריאים, סיכום ופירוש התוצאות וכתיבת הדו"ח. 5. שיטות סטטיסטיות: בניסוי שבוצע על שורות התאים כל התוצאות נותחו באמצעות מבחן T. התוצאות מוצגות בצורה של ממוצע ± סטיית תקן. בניתוח התוצאות התחשבנו גם בשונות על מנת להשוות בין קבוצות הניסוי. ערך של 0.05>p נחשב מובהק מבחינה סטטיסטית. השוואה בין קבוצת החולים לבריאים נעשתה באמצעות מבחן T, עם ערך סף למובהקות של.Levine's test המבחן בוצע בהנחת שונות שווה, לאחר בדיקה בעזרת 0.05=p.

10 תוצאות: השפעת CTLA4-FasL על תאי :RAJI התוצאות מצוטטות מתוך המאמר שיצא ממעבדתנו ב לכתב העת American Journal )25( of Pathology בשלב הראשון בדקנו את רגישות תאים ממאירים ממוצא של לימפוציטים מסוג B כגון שורת התאים,Raji שמקורה ב- lymphoma,burkit לפעילות החלבון. כפי שניתן לראות בתרשים מס' 2, CTLA4-FasL גרם לעיכוב קליטת התימידין בתאים יותר מאשר חלקיו ויותר מאשר חלבון כימרי אחר המכיל FasL אך אינו מכיל צד המאפשר לו להיקשר למולקולת B7. חיות תאי RAJI לעומת ביקורת לאחר טיפול בחלבונים CTLA4-,CTLA4-FasL ו- sfasl. Ig תרשים מספר 1 בתרשים מס 1 ניתן לראות את אחוז הקליטה של טימידין בשלב הגדילה של תאי RAJI בשלב הגדילה של התאים. ניתן לראות שתוספת של CTLA4-FasL מביאה לירידה סיגניפיקנטית בקליטה של טימידין דבר שמעיד על שיעור נמוך של תאים חיים.

11 בהמשך, רצינו לוודא כי פעילות החלבון CTLA4-FasL נגרמת על ידי אפופטוזיס. לצורך כך נבדקו התאים לאחר השרייתם עם החלבון או חלבון הבקרה באמצעות הערכה לצביעת ANNEXIN V ו- PI. כפי שניתן לראות בתרשים 1, רק בנוכחות CTLA4-FasL נצפתה אפופטוזיס משמעותית של תאי.Raji תרשים מס' 2 PI ANNEXIN-V בתרשים מס' 2 ניתן לראות את אחוז תאי ה- RAJI שעברו אפופטוזיס ו/או נקרוזיס בהשפעת החלבונים CD40-FasL,CTLA4-FasL לעומת בקרה בצביעת annexin ו- PI. ניתן לראות ששני החלבונים הכימרים מביאים לשיעור מוגבר של מוות בתאים אלו. כמו כן ניתן לראות שהחלבון CTLA4-FasL פוטנטי יותר מ- CD40-FasL בגרימת מוות תאי, זאת מכיוון שתאי RAJI לא מבטאים CD40L וכן מבטאים B7. בהמשך, על מנת לוודא כי יש חשיבות לקישור CTLA4-FasL לתאי ה- Raji מצד ה- B7, חסמנו באמצעות נוגדנים המכוונים כנד מולקולות B7 השונות,CD80 ו- CD86 את יכולת הקישור. ואכן כפי שניתן לראות בתרשים 2, נוכחות הנוגדן כנגד CD80 גרעה מפעילותו של החלבון באופן משמעותי, ובנוכחות שני הנוגדנים, היה עיכוב מלא של פעילות החלבון.

12 תרשים מס' 3 בתרשים מס' 3 ניתן לראות את אחוז הקליטה של טימידין בתאי RAJI לאחר טיפול ב- CTLA4-FasL בריכוז של 30ng/ml לצד טיפול בנוגדנים חוסמים ל- B7. ניתן לראות שטיפול ב- anti CD80 לבד ויחד עם anti CD86 מביאים לשיעור גבוה יותר של קליטת טימידין בקרב תאים אלו מה שמלמד אותנו שכדי להשיג אפקט מקסימלי החלבון הכימרי CTLA4-FasL פועל דרך שתי הקצוות שלו. יש לציין ש- anti CD86 לבד לא השפיע על אחוז קליטת הטימידין. כמו כן ניתן לראות שתוספת של נוגדנים לא קשורים גם לא השפיע על אחוז קליטת הטימידין. את חשיבות יכולת הקישור של צידו השני של החלבון FasL לא בדקנו בעבודה זו מאחר ועבודות הדגימו זאת כבר בעבר )5,1,8(.

13 השפעת החלבון הכימרי CTLA4-FasL על תאי B של חולי CLL ושל מתנדבים בריאים: זיהוי תאי B ומצב החיות שלהם לאחר 33 שעות אינקובציה: לאחר שראינו כי תאי B ממאירים אכן רגישים לנוכחות החלבון, ועוברים אפופטוזיס בנוכחותו, CLL B פנינו לבדוק את השפעת CTLA4-FasL על תאי שנלקחו מחולי וממתנדבים בריאים. B בכל ניסוי, למרות שנעשה על כלל התאים המונוקליארים שנלקחו, זוהתה אוכלוסיית תאי באמצעות צביעה כנגד.CD19 כמודגם בתרשים 1. התוצאות מובאות בהמשך מתייחסות רק לתאים שנצבעו חיובית ל- CD19, קרי תאי B. תרשים מס' 4 B בתרשים מס' 1 ניתן לראות תאי אשר נצבעו ב- CD19.ניתן לראות שהצביעה מאפשרת 56.5% הפרדה מלאה של תאי ה- B משאר האוכלוסיות אשר לא נצבעות. במקרה הזה, מהלימפוציטים נצבעו ל- CD19, דבר אשר מאפיין חולי :CLL אחוז התאי B בדם גבוה מהרגיל ולעיתים מגיע גם למעלה מ%. 9.

14 תרשים מס' 5 תרשים מס' % 29.96% 10 3 PI % 13.50% Annexin V בתרשים מס' 5 ניתן לראות דוגמא של צביעה ל- V Annexin )בציר האופקי( ו- PI )בציר האנכי(, אשר מדגימה חיות של תאי בתרשים מוצגים רק תאים אשר חיוביים ל- CD19. B. ברביע התחתון שמאלי נמצאים תאים אשר לא נצבעו בכלל, אשר הינם חיוניים. ברביע הימני תחתון נמצאים תאים שנצבעו רק ל- V,Annexin אשר מזוהים אם כן כתאים בשלבי ההתחלה של אפופטוזיס. ברביע הימני העליון נמצאים תאים שבנוסף ל- V Annexin נצבעו ל- PI, דבר אשר מזהה אותם כתאים בשלבים מתקדמים של אפופטוזיס ותהליך המוות. השפעת החלבון הכימרי CTLA4-FasL על תאי B של מתנדבים בריאים בטבלה מס' 2 מסוכמות התוצאות של 6 המתנדבים הבריאים, כאשר: עמודת ה- Untreated מייצגת את התאים לאחר 26 שעות אינקובציה ללא כל טיפול. עמודת ה- CTLA4-Ig מייצגת את התאים אשר טופלו בחלבון CTLA4-Ig בלבד. העמודות HC4 מייצגות את התאים אשר טופלו בחלבון הכימרי, בריכוזים עולים של, ו-.. 2.ng/mL

15 טבלה מס' 1 Subject Test Untreated CTLA4-Ig HC4-30 HC4-100 HC mean Viable 38% 48% 38% 75% 72% non-viable 62% 52% 62% 25% 28% Viable 88% 63% 75% 80% 63% non-viable 12% 37% 25% 20% 37% Viable 70% 59% 87% 57% 81% non-viable 30% 41% 13% 43% 19% Viable 52% 61% 54% 51% 52% non-viable 48% 39% 46% 49% 48% Viable 41% 48% 54% 51% 36% non-viable 59% 52% 46% 49% 64% Viable 17% 27% 22% 21% 18% non-viable 83% 73% 78% 79% 82% Viable 51% 51% 55% 56% 54% non-viable 49% 49% 45% 44% 46% כפי שניתן לראות מהממוצעים, הוספת החלבונים CTLA4-FasL ו CTLA4-Ig לא השפיעה על חיות תאי ה- B )0.05<p(.

16 השפעת החלבון הכימרי CTLA4-FasL על תאי B של חולי CLL בטבלה מס' 1 מסוכמות התוצאות של 6 המתנדבים הבריאים, כאשר: עמודת ה- Untreated מייצגת את התאים לאחר 26 שעות אינקובציה ללא כל טיפול. עמודת ה- CTLA4-Ig מייצגת את התאים אשר טופלו בחלבון CTLA4-Ig בלבד. אותו כנ"ל לעמודות ה- sfasl ו- CTLA4.Ig.sFasL + העמודות HC4 מייצגות את התאים אשר טופלו בחלבון הכימרי, בריכוזים עולים של, ו-.. 2.ng/mL

17 טבלה מס' 2 Subject Test Untreated CTLA4-Ig sfas sfas + CTLA4.Ig HC4-30 HC4-100 HC mean Viable 70% 52% 76% 67% non-viable 30% 48% 24% 33% Viable 92% 79% 79% 73% 92% 88% 92% non-viable 8% 21% 21% 27% 8% 12% 8% Viable 45% 0% 26% 58% 33% 40% 36% non-viable 55% 100% 74% 42% 67% 60% 64% Viable 48% 48% 27% 52% 46% 49% 38% non-viable 52% 52% 73% 48% 54% 51% 62% Viable 53% 32% 25% 51% 39% 19% 29% non-viable 47% 68% 75% 49% 61% 81% 71% Viable 83% 87% 89% 92% 86% 73% 34% non-viable 17% 13% 11% 8% 14% 27% 66% Viable 44% 41% 62% 69% 71% 68% 62% non-viable 56% 59% 38% 31% 29% 32% 38% Viable 14% 14% 16% 8% 5% 6% 12% non-viable 86% 86% 84% 92% 95% 94% 88% Viable 56% 43% 46% 58% 53% 52% 46% non-viable 44% 57% 54% 42% 47% 48% 54% כפי שניתן לראות מהממוצעים המוצגים בטבלה 1 הוספת החלבונים השונים לא השפיעה על חיות תאי ה- B )0.05<p( גם במקרה של תאים שנדגמו בחולי.CLL למרות שבחלק מהחלבונים שנבדקו נראה כאילו אחוז החיות של התאים שונה מקבוצת הביקורת, לאור השונות הגדולה בין החולים, לא נמצאה מובהקות סטטיסטית להבדלים אלה. תוצאה

18 מעניינת היא השילוב של שני החלבונים האלה גם יחד, אשר הביאה לתוצאה דומה לתאים הלא מטופלים, בניגוד לציפייה שלנו לאפקט אדיטיבי בגרימת מוות. כאשר טיפלנו בתאי ה- CLL עם החלבון הכימרי, ראינו נטייה לאפקט תלוי ריכוז אשר הביא לירידה בחיות: בריכוז של.2,ng/mL נצפתה השפעה מועטה על התאים וירידה בחיות ל- 52%. בעליה ל-.. 2 ng/ml חלה ירידה קלה נוספת ל- 51%. בשימוש ב- 300ng/mL, נצפתה ירידה גדולה בחיות ל- 16%. כל התוצאות הללו לא היו מובהקות סטטיסטית )0.05<p(. השוואת אפקט החלבון הכימרי CTLA4-FasL על תאי B בין מתנדבים בריאים וחולי CLL 60% 50% בריאים חולים תרשים מס' 6 אחוז תאים חיים 40% 30% 20% 10% 0% Untreated HC4-30 HC4-100 HC4-300 בתרשים מס' 6 מסוכמות התוצאות של החיות של הניסויים במתנדבים בריאים למול חולי ה-.CLL ניתן לראות שהחלבון הכימרי הביא לירידה תלוית מינון בחיות תאי ה- B בחולי CLL )אם

19 כי לא מובהק סטטיסטית(, ואילו במתנדבים בריאים ההשפעה על החיות הייתה זניחה, ואף גרמה לעליה קלה.

20 דיון: CTLA4-FasL מחקר זה הוא הראשון מסוגו שבודק את יכולת החלבון הכימרי להשרות אפופטוזיס על תאי.CLL בעבודה זו הסתמכנו על מחקרים קודמים במעבדתנו שהדגימו כי לחלבון הכימרי הזה ולדומיו )כדוגמת )CD40-FasL יש את היכולת להקשר משתי הקצוות שלו לרצפטורים המתאימים על פני התא ולהשרות אפופטוזיס במנגנון של.CLBP Raji השראת אפופטוזיס B בשורות תאי ממאירים מסוג ע"י החלבון הכימרי :CTLA4-FasL מחקרים קודמים שנערכו במעבדתנו הדגימו כי לחלבון הכימרי CD40-FasL קיימת היכולת T בתאי )cis loop back protein( לפעול במנגנון של CLBP המבטאים קולטנים לשני מרכיבי החלבון, כלומר CD40 ו- receptor.fas מנגנון ה- CLBP הינו מנגנון שבו חלבון כימרי פועל על אותו תא בשתי קצוותיו כדי ליצור אפקט ביולוגי סינרגיסטי. במקרה הנ"ל, החלבון CD40-FasL נקשר לתא T משתי קצוותיו ומצמד באותו תא את תהליך עיכוב הקוסטימולציה לאפופטוזיס. טיפול בתאי T שמבטאים CD40 עם החלבון הכימרי הביא לשיעור גבוה יותר של אפופטוזיס בהשוואה לטיפול ב- Fas לבד או לטיפול ב FasL ו- CD40 ביחד. בניסוי שלנו ניסינו לבדוק האם לחלבון הכימרי CTLA4-FasL יש את היכולת לפעול במנגנון של CLBP בתאי,CLL במנגנון שמזכיר את הפעולה של החלבון הכימרי,CD40-FasL מכיוון שתאי מבטאים B7 ו- FasR ולכן החלבון שלנו יכול לפעול על אותו תא משני צידיו. התחלנו עם CLL שורת תאי RAJI המבטאת גם היא את 1 המולקולות על מנת להראות כי הפעולה אפשרית. מניתוח התוצאות הנ"ל הראנו כי לחלבון הכימרי CTLA4-FasL קיימת היכולת להשרות אפופטוזיס בתאי B ממאירים מסוג.Raji יכולתו להשרות אפופטוזיס הייתה גבוהה יותר מס"כ

21 מרכיביו והפוטנטיות שלו בהשראת אפופטוזיס נשענת על יכולתו להקשר משתי קצוותיו לקולטנים על פני התא ובכך לצמד תהליכים שמביאים בסופו של דבר למוות של התאים. המנגנון המולקולרי המשוער שבו פועל החלבון CTLA4-FasL הוא על ידי דיכוי אותות אנטי אפופטוטיים על ידי הפחתת ביטוי ה- cflip )26(, במקביל להפעלת אותות פרו-אפופטוטיים המווכים על ידי קספזות. אחד החלבונים שמבוטא ביתר בתאי Raji הינו החלבון.cFLIP רמות גבוהות שלו קשורות בשרידות גבוהה יותר של התא. מנגנון הפעולה שלו הוא תחרות על קישור לקומפלקס המוות עם קספס 8, שמהווה פקטור חשוב בשרשרת הפעלת הקספסות המביאות בסופו של דבר למוות של התא במנגנון של אפופטוזיס )26(. במאמר שפרסמנו בדקנו האם חשיפה של תאי Raji מביאה לירידה ברמות של cflip וכפועל יוצא לעלייה ברמות של קספס 8. ואכן חשיפה של תאים ממאירים מסוג Raji לחלבון CTLA4- FasL הביאה לירידה בביטוי )26(. cflip ירידה זו ב- cflip לא נצפתה כאשר התאים טופלו ב- FasL מסיס, ב- CLA4-Ig או בשילוב של שניהם בריכוזים דומים )26(. כלומר, דרך הפעולה של CTLA4-FasL בתאי Raji היא על ידי ירידה ברמות של cflip במקביל להפעלה של קספזות, מה שמביא לשיעור מוגבר של אפופטוזיס. CTLA4- B השראת אפופטוזיס בתאי CLL ותאי בריאים ע"י החלבון הכימרי :FasL בחלקה השני של העבודה בדקנו את יכולת החלבון CTLA4-FasL להשרות מוות של תאי CLL 2 ושל תאי B ממתנדבים בריאים. מניתוח התוצאות של טבלאות ו- 1 ניתן לראות כי למרות שנמצאה נטייה לירידה בחיות תאי CLL בריכוז גבוה של החלבון הכימרי,CTLA4-FasL לנטייה

22 זו לא הייתה משמעות סטטיסטית. באופן מעניין נטייה לירידה בחיות תאי B לא נמצאה כלל בתאים שנלקחו ממתנדבים בריאים. הסברים רבים עשויים להיות לממצא זה. תאי לוקמיה לימפואידית כרונית, בניגוד לתאים של לוקמיה חריפה לא מתאפיינים בקצב חלוקה מהיר. מניסויים קודמים בו נבדקה יכולתו של CTLA4-FasL להשרות מוות בתאים, נמצא כי הוא יעיל במיוחד בתאים הנמצאים בחלוקה מהירה )כמו תאי T מאוקטבים, או שורות תאי B ממאירות המתחלקות בקצב מהיר(. ממצא זה מאפין גם FasL מסיס או נוגדנים המפעילים את הקולטן.Fas בנוסף, הראנו בעבר, כי הרגישות של התאים האלה ל- CTLA4-FasL נובעת מכך שהחלבון מסוגל לדכא אותות אנטי-אפופטוטיים במקביל להפעלת מסלול האפופטוזיס, ובכך גורם למוות מוקדם ויעיל במיוחד של התאים המתחלקים. ייתכן כי תאי CLL מתאפיינים בכך שהם מפתחים מנגנונים אחרים המקנים להם עמידות בפני אפופטוזיס שאינם מושפעים על ידי החלבון. למשל, סקירה של הספרות מראה כי לתאי CLL קיימת עמידות אינהרנטית כנגד גירויים אפופטוטיים המתווכים דרך מסלול ה- Fas. אחד המנגנונים המתוארים כמקנים עמידות לתאי Fas ( TOSO הוא המסלול המתווך בידי ביטוי ביתר של החלבון הטרנסממברנלי CLL.)21( )inhibitory molecule 3.Fas חלבון זה הינו חלבון מעכב היודע להקשר בחלקו ה- C טרמינלי לחלק התוך תאי של CLL מחקרים רבים הדגימו כי ביטוי ביתר של TOSO קשור בשיעור גבוה של תאי בספירות דם, במחלה אגרסיבית יותר, ב- stage קליני גבוה יותר stage( )Binet ובשיעור גבוה יותר של CLL צורך בטיפול כמותרפי. אחד המנגנונים המביאים לעלייה בביטוי של TOSO בתאי היא שפעול של ה- BCR receptor( B( cell )21(. וכן אותות קו סטימולטורים המתווכים על ידי TOSO T אינטראקציה בין CD40L על תאי ל- CD40 על תאי ה- CLL. לא בדקנו את ביטוי בתאים שטופלו ב- CTLA4-FasL אך יתכן והוא זה הגורם לעמידות לחלבון. השימוש בחלבון

23 בתאי CLL הכימרי CD40L-Fc-FasL הנקשר ל- CD40 מביאה לשיעור מוגבר של אפופטוזיס. המנגנון שמוצע הוא שהחלבון הכימריCD40L-Fc-FasL מביא לירידה בשיעור הביטוי של Fas ובכך הופך את תאי ה- CLL לרגישים יותר לאפופטוזיס שנגרם באמצעות )ראה TOSO תרשים מס 1( )21(. CD40 תרשים מס' 1: תרשים המסכם את המודל של תכונותיו האנטי-אפופטוטיות של החלבון TOSO בתאי B ביטוי ביתר שלו מביא לעמידות בפני אפופטוזיס המתווך באמצעות.Fas שפעול של CD40 מביא לירידה בביטוי שלו, בעוד שקישור ל- BCR מביא לעלייה בביטוי שלו.

24 גם מבחינת מערך הניסוי ניתן להצביע על שלוש בעיות מרכזיות בניתוח התוצאות: B 2. חלבון הניסוי )CTLA4-FasL( נבדק על PMBC ולא על תאי לבד. כידוע, תאי דם לבנים נוספים, כדוגמת תאי T, מבטאים על פני קרום התא רצפטור ל- Fas וגם.CD28 דבר זה יתכן והשפיע על היכולת של החלבון שלנו להקשר ולהשפיע על תאי ה- CLL. כמו כן יתכן והחלבון הכימרי השפיע על תאי דם לבנים אחרים ששהו במדיום, דבר שהביא לשחרור חומרים אחרים למדיום )ציטוקינים, אינטרלוקינים וכו'( ולכך יכלו להיות השפעות על תוצאות המחקר. הסיבה שלא בודדנו את תאי ה- CLL היא שהוכח מחקרית כי תאים אלו לא שורדים במדיום בלי הסביבה הטבעית שלהם. כלומר, אם היינו מבודדים את תאי ה- CLL מיתר התאים היינו מקבלים שיעור גבוה של אפופטוזיס שלא היינו יודעים האם לייחסו לטיפול שלנו או למוות טבעי שתאים אלו עוברים כאשר הם מבודדים מהסביבה הטבעית שלהם. כמו כן, נהוג להניח, בספרות, כי כמעט כל ה PBMC בחולי CLL הם תאי ה B הממאירים )28(. 1. קושי נוסף מובנה שקיים במחקר הוא העובדה שהניסוי בוצע על תאי CLL שהופקו ממתנדבים חולים. תאי ה- CLL הופקו מחולים שנמצאו בשלבי מחלה וטיפול שונים. בנוסף, חלק מהחולים היו תחת טיפול תרופתי, חלק סיימו טיפול תרופתי וחלק מעולם לא נחשפו לטיפול תרופתי. יתכן ולמשך המחלה, לשלב הקליני שבו נמצא היה החולה והטיפול שקיבל החולה הייתה השפעה על דרגת העמידות של התאים בפני השראת מוות תאי מתוכנן. כלומר, יתכן שתאי ה- CLL מחולים שונים היו שונים בינם ובין עצמם, דבר אשר יכול לגרום ל- confounding של התוצאות. B7 2. אנו סמכנו על מחקרים קודמים שהוכיחו כי תאי CLL מבטאים על קרום התא אך לא בדקנו את הביטוי של B7 על תאי ה- CLL שדגמנו במחקר זה. הסיבה שלא בדקנו זאת היא שסה"כ התאים שהופקו מהחולים לא הייתה בכמות שאיפשרה לבצע גם את ניסוי זה. יתכן B7 הייתה נמוכה או שהיה הבדל באחוז הביטוי של ובתאי ה- CLL שדגמנו כמות הביטוי של

25 B7 בין חולים שונים דבר שבהחלט יכל להשפיע על תגובת התאים לטיפול בחלבון הניסוי שלנו.CTLA4-FasL פעילות פרו-אפופטוטית של החלבון הכימרי CTLA4-FasL למרכיביו בנפרד sfas( ו- CTLA4-Ig (: בהשוואה לאחר ניתוח של התוצאות לא הצלחנו להדגים הבדל בין יכולת החלבון הכימרי CTLA4-FasL להשרות אפופטוזיס לבין סך מרכיביו בנפרד או ביחד. אנו שיערנו שהחלבון הכימרי שלנו יפעל במנגנון של צימוד תהליכי אפופטוזיס לעיכוב תהליכים אנטי אפופטוטיים, כלומר אנו ניסינו להדגים כי קישור של החלבון משני קצוותיו לאותו תא יביא לערור יתר של מנגנון האפופטוזיס שמתווך בידי,Fas דבר שלא הצלחנו להדגים בפועל. תוכניות להמשך המחקר הממצאים עד כה פותחים נתיב לניסויי המשך בהקשר של השפעת CTLA4-FasL על תאי :CLL אנו יודעים על סמך עבודות קודמות במעבדתנו שהחלבון CTLA-4-FasL קשור - בהשראת אפופטוזיס על ידי עלייה בפעילות של קספסות וירידה בביטוי של החלבון האנטי אפופטוטי.cFLIP יהיה מעניין לראות האם לחלבון יש השפעה דומה בתאי CLL גם ככלי לבדוק את מנגנון הפעולה של החלבון בתאים אלו וגם כדי להעריך מדוע לא הצלחנו להשרות אפופטוזיס בתאים אלו. ישנם מספר פקטורים הידועים כמעלים את הביטוי של B7-1 ו- B7-2 המסוגלים - לקשור את ה- CTLA4 בחלבון הכימרי. יהיה מעניין לבדוק האם שימוש בפקטורים אלו יחד עם החלבון שלנו יביא לעלייה באחוז האפופטוזיס של תאי CLL לאחר טיפול ב-.CTLA4-FasL

26 CLL יש מקום לבדוק האם רמות ה- TOSO המבוטאות בתאי או פקטורים אנטי - אפופטוטיים אחרים כגון BCL2 או BCL6 גבוהות בתאים ומושפעות מטיפול ב-- CTLA4.FasL

27 לסיכום, תאים לימפוציטים ממאירים מסוגלים לרכוש עמידות בפני אפופטוזיס באמצעות מספר,DISC דרכים: אובדן ביטוי של ה-,Fas receptor התערבות ביצירת ה- התערבות בהפעלת מפל הקספזות ברמת ה- DISC, יצירה מופחתת של קספזות במורד המפל ועל ידי ביטוי יתר של אותות אנטי אופטוטים בשלבים שונים של התהליך. דוגמא לחשיבות מנגנון ביטוי היתר של אותות אנטי-אפופטוטים ניתן למצוא בלימפוציטים. לאחרונה, רווחיים יותר ניסיונות שמטרתם לשלב בין חסימה באמצעות חלבונים כימריים. של אותות אנטי אפופטוטיים לבין עיכוב אקטיבי של התאים קבוצה ייחודית של חלבונים כימריים הנמצאת במחקר בהקשר הזה היא הקבוצה של ה- ו-ה.CLBP החלבון הראשון והאבטיפוס למשפחה זו הינו ה-.CTLA-4-FasL חלבון זה TSCP מכיל בתוכו את היכולות המשלימות להקשר ל- B7 ולחסום את הקו-סטימולציה דרך הזרוע של CTLA-4 ובמקביל לספק אות מעכב, שיעודד מוות תאי דרך הזרוע של Fas-L ובכך בעצם הופך את סיגנל האות המשפעל למעכב. B7 לימפומות מסוג B מבטאות על פני התאים גם מולקולת וגם.Fas-Receptor בנוסף, ידוע כי בחלקן יש עמידות לאפופטוזיס המתווכת על ידי עלייה בחלבונים אנטי-אפופטוטיים שונים. הוראה, כי חלק מהחלבונים האנטי אפופטוטיים עולים משנית לגירוי תאי ה- B באמצעות הנקשר ל- B7. תאי RAJI )שמקורם ב- Lymphoma )Burkit ותאי לוקמיה כרונית )CLL( CD28 הם תאים מסוג B לימפוציטים, הידועים בכך שהם עמידים בפני גירויים המשרים אפופטוזיס. תאים אלה מבטאים על קרום התא גם B7 וגם.Fas receptor אנו שיערנו שהחלבון הכימרי CTLA-4-FasL מסוגל להשרות אפופטוזיס בתאי דם לבנים CLBP שעברו טרנספורמציה ממארת כפי שקורה ב- CLL במנגנון משוער של ויכולת זו תהיה גבוהה מיכולתו להשרות אפופטוזיס בלימפוציטים של מתנדבים בריאים. בנוסף שיערנו כי

28 יכולתו להשרות אפופטוזיס עולה על יכולת שני החלקים המרכיבים אותו להשרות אפופטוזיס באותם תאים. כדי לבדוק את שיעור האפופטוזיס של הלימפוציטים נעזרנו בצביעה עם Annexin V ו-.FACS וביצענו אנליזה כמותית בשיטת )PI( Propidium Iodide CTLA4-FasL בתאי RAJI אכן מצאנו כי השרה אפופטוזיס יעיל באמצעות הפעלת הקספסות במקביל לדיכוי האות האנטי אפופטוטי.cFLIP חשוב לציין כי החלבון נמצא יעיל בהרבה מחלקיו. לעומת זאת, לא נמצא הבדל משמעותי סטטיסטית בין שיעור החיות של תאי CLL לעומת לימפוציטים של מתנדבים בריאים לאחר טיפול בחלבון הכימרי. כמו כן התוצאות לא הדגימו הבדל משמעותי סטטיסטית בין יכולת החלבון הכימרי CTLA4-FasL להשרות אפופטוזיס בתאי CLL בהשוואה למרכיביו )יחד ולחוד(. יתכן כי תוצאות אלו מצביעות על כך שהמנגנון הקו-סטימולטורי )הקישור של CD28 ל- B7 ( בתאי CLL לא מהווה את המנגנון העיקרי המביא לעמידות התאים האלו בפני אפופטוזיס. עוד יתכן כי יכולת העיכוב של הקו-סטימולציה להשפיע על רגישות תאי ה- CLL לאפופטוזיס במסלול ה- Fas זניחה בהשפעה לעמידות האינהרנטית שיש לתאים אלו לאפופטוזיס במסלול זה, כפי שמתווך בידי גורמים אחרים שנידונו קודם לכן.

29 Summary: Malignant lymphocytes cells are able to acquire resistance to apoptosis through a number of ways: loss of expression of the Fas receptor, intervention at the level of the DISC formation, intervention at the level of the caspase cascade at the level of the DISC, reduced creation of caspase downstream and by overexpression of antiapoptotic signals at different stages of the process. An example of the importance of overexpression of anti-apoptotic signals can be found in lymphocytes. Recently, efforts to combine the actions of blocking anti-apoptotic signals and the active inhibition of cells by using chimeric proteins had proved to be useful. A unique set of chimeric proteins discussed in the context of this study are the group of the TSCP and the CLBP. The first protein and the prototype of this family is the CTLA-4-FasL. This protein contains the complementary capabilities to interact with B7 molecules and block the co-stimulation through the arm of CTLA-4 and also provide an inhibitory signal that encourages cell death through the Fas-L arm thereby changes the activating signal to an inhibitor one. B cell lymphomas express the cell surface molecule B7 and also Fas-receptor. In these cells, it is known that there is resistance to apoptosis mediated by an increase of different anti-apoptotic proteins. It is known that the activation of some of the anti-apoptotic proteins is mediated through the B cell stimulation via CD28 that binds to B7. RAJI cells (originating in Burkit Lymphoma) and chronic leukemia cells (CLL) B-cells are lymphocytes, known to be resistant to apoptotic induced stimuli. These cells express on their cell membrane Fas receptor and B7.

30 We suggested that the chimeric protein CTLA4-FasL can induce apoptosis in B cells that underwent malignant transformation, like CLL cells, by working as a CLBP. We assumed that its ability to induce apoptosis in CLL cells would be significantly higher when compared to cells of healthy volunteers. In addition, we hypothesized that CTLA4-FasL ability to induce apoptosis exceeds the ability of its two components (Fas-L and CTLA4-Ig combined and separately) in these cells. We measured the rate of lymphocyte apoptosis by using Annexin V and Propidium Iodine staining followed by FACS method to perform quantitative analysis. As expected, we found that in Raji cells CTLA4-FasL effectively induced apoptosis through activating the caspase cascade and by suppressing the anti-apoptotic signal cflip. However, no statistically significant difference was found between the percentage of viability in CLL cells compared with lymphocytes of healthy volunteers after treatment with CTLA4-FasL. The results also showed no statistically significant difference between the ability of the chimeric protein CTLA4-FasL to induce apoptosis in CLL cells compared with its components (separated or combined). It is possible that these results indicate that the mechanism of the co stimulation (the B7-CD28 interaction) in CLL cells is not the main mechanism that results in CLL resistance to apoptosis. Moreover it is possible that the ability to inhibit or delay the co stimulation via the Fas pathway in CLL cells is negligible due to inherent resistance to apoptosis in these cells, as mediated by different factors previously discussed.

31 ביבליוגרפיה 1. Irene Munk Pedersen & John C. Reed, 2004, Microenvironmental Interactions and Survival of CLL B-cells, Leukemia & Lymphoma, Noel, P. J., L. H. Boise, J. M. Green, C. B. Thompson CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J. Immunol. 157: Lu, L., S. Qian, P. A. Hershberger, W. A. Rudert, D. H. Lynch, A. W. Thomson Fas ligand (CD95L) and B7 expression on dendritic cells provide counter-regulatory signals for T cell survival and proliferation. J. Immunol.158: Li, Y., X. C. Li, X. X. Zheng, A. D. Wells, L. A. Turka, T. B. Strom Blocking both signal 1 and signal 2 of T-cell activation prevents apoptosis of alloreactive T cells and induction of peripheral allograft tolerance. Nat. Med. 5: Jui-Han Huang, Mark L. Tykocinski CTLA-4-Fas ligand functions as a trans signal converter protein in bridging antigen-presenting cells and T cells. International Immunology 13: Ariel Orbach, Jacob Rachmileitz, MiramParnas, Jui-Han Huang, Mark L. Tykocinski, and Michal Dranitzki-Elhalel CTLA-4-FasL Induces Early Apoptosis of Activated T cells by Interfering with Anti-Apoptotic Signals. The Journal of Immunology 179: Michal DranitzkiElhalel, Jui-Han Huang, William Schmidt, Jacob Rachmilewitz, and Mark L. Tykocinski CTLA-4-FasL Induces

32 Alloantigen-Specific Hyporesponsiveness. The Journal of Immunology 170: M. Dranitzki-Elhalel, J-H. Huang, J. Rachmilewitz, O. Pappo, M. Parnas, W. Schmidt, M. L. Tykocinski CTLA-4-FasL inhibits allogenic responses in vivo. Cellular Immunology 239: M. Dranitzki-Elhalel, J.H. Huang, M. Sasson, J. Rachmilewitz, M. parnas and M.L. Tykocinski CD40-FasL inhibits human T cells: evidence for an auto-inhibitory loop-back mechanism. International Immunology 19: Romano MF, Lamberti A, Tassone P, et al: 1998 :Triggering of CD40 antigen inhibits fludarabine-induced apoptosis in B chronic lymphocytic leukemia cells. Blood 92: Kitada S, Zapata JM, Andreeff M, et al: 1999 :Bryostatin and CD40-ligand enhance apoptosis resistance and induce expression of cell survival genes in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 106: Granziero L, GhiaCircosta P, et al: 2001 :Survivin is expressed on CD40 stimulation and interfaces proliferation and apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 97: Lomo J, Blomhoff HK, Jacobsen SE, et al: 1997 Interleukin-13 in combination with CD40 ligand potently inhibits apoptosis in human B lymphocytes: Upregulation of Bcl-xL and Mcl-1. Blood 89: SusmitSuvas, Vinod Singh, SudhirSahdev, HarpreetVohra, and Javed N. Agrewala 2002 Distinct Role of CD80 and CD86 in the Regulation of the Activation of B Cell and B Cell Lymphoma J. Biol. Chem., 277, (10)

33 15. Daniel Widney, W. John Boscardin, ArjangKasravi, OtonielMartínez- Maza2003 Expression and Function of CD28 on Epstein-Barr Virus-Positive B Cell Lines and AIDS-Associated Non-Hodgkin's Lymphoma Cell Lines Tumor Biol;24: Ariel Orbach, Jacob Rachmilewitz, Noam Shani, Yonatan Isenberg, Miriam Parnas, Jui-Han Huang, Mark L. Tykocinski and Michal Drantzki-Elhalel, 2010 CD40-FasL and CTLA4-FasL Fusion Protein induce apoptosis in malignant cell lines by dual signaling, The American journal of Pathology, Vol 177, no Christian Philipp Pallasch& Clemens Martin Wendtner, 2009 Overexpression of the Fas-Inhibitory molecule TOSO a novel anti apoptotic factor in chronic lymphocytic leukemia, Leukemia & Lymphoma 50 (3): Michael Hallek, Chronic lymphocytic Leukemia, 2013 update on diagnosis, risk stratification and treatment, American journal of Hematology, volume 88, issue 9,